人促血液血管細胞生成素功能性受體的探索和靶向粘附斑激酶（FAK）的RNA干擾研究.pdf

1、第一部分：人促血液血管細胞生成素的功能性受體nucleolin的鑒別 人促血液血管細胞生成素(HAPO)是實驗室首先報道的一種對血液血管干細胞有促增殖作用的細胞因子。對HAPO的生物學功能研究發(fā)現(xiàn)，HAPO體外可以促進成人骨髓細胞的增殖。對胎兒骨髓的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)HAPO可以促進骨髓的造血細胞(懸浮細胞)和基質(zhì)細胞(貼壁細胞)的增殖，因而推測HAPO主要作用于早期的造血干細胞和內(nèi)皮細胞。體外實驗中還發(fā)現(xiàn)HAPO可以通過激活PI

2、3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑抑制白血病細胞系MO7e的凋亡。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HAPO的小鼠骨髓基質(zhì)細胞體外具有造血支持作用。雖然對HAPO的生物學功能和信號通路有了一定的理解，但是HAPO的受體還未知。 在本研究中，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)HAPO可以促進人臍靜脈來源的細胞系ECV304的粘附和遷移，并呈現(xiàn)劑量的依賴性。由于其他已經(jīng)研究的細胞或者因為技術(shù)上的難度不容易獲得或者需要依賴細胞因子生長從而代價昂貴，因此選擇ECV304細胞作為研究H

3、APO受體的靶細胞。通過生物素標記的HAPO與ECV304細胞孵育發(fā)現(xiàn)HAPO確實可以結(jié)合在ECV304細胞上。進一步利用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)HAPO組較對照組多了一條110KD的蛋白帶，將該條帶送到國家生物分析中心進行質(zhì)譜測序，通過和基因庫里的序列比較發(fā)現(xiàn)該蛋白是核仁蛋白(nucleolin)。由于核仁蛋白是主要表達于核內(nèi)的蛋白質(zhì)，所以首先檢測了核仁蛋白在ECV304細胞膜上的表達。分別利用流式細胞術(shù)、提取膜蛋白的方法檢測蛋白的表達，

4、最終發(fā)現(xiàn)核仁蛋白確實表達在ECV304細胞的細胞膜上，這與已經(jīng)報道的文獻吻合。進一步實驗中，利用蛋白質(zhì)overlay的方法檢測到在物理水平上HAPO與核仁蛋白確實可以互相結(jié)合?；罴毎捕ㄎ粚嶒炦M一步證明了HAPO在活細胞的水平上也可以與核仁蛋白相結(jié)合。為了證明核仁蛋白是HAPO的功能性受體，利用核仁蛋白的抗體進行了阻斷實驗，發(fā)現(xiàn)在有100倍摩爾濃度的核仁蛋白抗體存在的情況下，HAPO對ECV304細胞的促粘附作用受到了抑制，因此可以確定

5、表達在細胞表面的核仁蛋白是HAPO的功能性受體。為了進一步確認這一點，構(gòu)建了pcDNA3.1-nucleolin載體，并將其轉(zhuǎn)染到細胞表面核仁蛋白陰性的人胚腎上皮細胞HEK293中，轉(zhuǎn)染后16小時，利用流式細胞術(shù)的方法檢測細胞表面的核仁蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)16小時后293細胞表面確實表達了核仁蛋白。利用轉(zhuǎn)染后的細胞進行遷移實驗，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染細胞以及轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞相比，HAPO大大促進轉(zhuǎn)染細胞的遷移。這些結(jié)果進一步說明了核仁蛋白是HAPO

6、的功能性受體。 總之，鑒定了核仁蛋白是HAPO的功能性受體，并發(fā)現(xiàn)它與HAPO的一些生物學功能相關(guān)，這值得進行進一步的研究以加深對HAPO生物學功能和作用機制的理解。 第二部分FAK在人白血病細胞系k562中的表達與細胞的增殖、分化細胞周期、藥物敏感性的關(guān)系 研究背景：粘附集中點激酶(FAK)是一個粘附集中點激酶(FAK)是一個非受體型的酪氨酸激酶，定位在細胞與細胞外基質(zhì)接觸的地方，即粘附集中點(focaladh

7、esion)。FAK可以協(xié)調(diào)來自整合素(integrin)、細胞因子、生長因子受體以及原癌基因的信號，從而調(diào)節(jié)細胞的很多活動，如：增殖、凋亡、遷移、細胞周期等。FAK在多種類型的腫瘤細胞中過表達或持續(xù)活化，并與腫瘤細胞的運動、浸潤、增殖的增加有關(guān)。雖然FAK在實體瘤中的研究進展已經(jīng)很多，但是關(guān)于FAK在正常骨髓細胞和白血病細胞中的表達和作用的研究還十分少。 目的：利用Bcr-Abl陽性的慢粒細胞系k562，通過RNA干擾的方法來

8、研究FAK對慢粒白血病細胞的功能的影響。 方法：合成針對FAK序列的寡核苷酸，退火后，經(jīng)酶切連接入可以表達短發(fā)夾RNA的pGE-1載體，將載體轉(zhuǎn)染入人慢粒白血病細胞系k562中，經(jīng)G418篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體的細胞株，經(jīng)過RT-PCR、westernblot兩種方法鑒定干擾的效率。隨后采用MTT染色檢測干擾FAK表達后，k562細胞的增殖情況。采用PI染色法，通過流氏檢測和軟件計算來檢測干擾后細胞周期的變化。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和對照