人促血液血管細(xì)胞生成素功能性受體的探索和靶向粘附斑激酶（FAK）的RNA干擾研究.pdf

1、第一部分：人促血液血管細(xì)胞生成素的功能性受體nucleolin的鑒別 人促血液血管細(xì)胞生成素(HAPO)是實驗室首先報道的一種對血液血管干細(xì)胞有促增殖作用的細(xì)胞因子。對HAPO的生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，HAPO體外可以促進(jìn)成人骨髓細(xì)胞的增殖。對胎兒骨髓的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)HAPO可以促進(jìn)骨髓的造血細(xì)胞(懸浮細(xì)胞)和基質(zhì)細(xì)胞(貼壁細(xì)胞)的增殖，因而推測HAPO主要作用于早期的造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。體外實驗中還發(fā)現(xiàn)HAPO可以通過激活PI

2、3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑抑制白血病細(xì)胞系MO7e的凋亡。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HAPO的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外具有造血支持作用。雖然對HAPO的生物學(xué)功能和信號通路有了一定的理解，但是HAPO的受體還未知。 在本研究中，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)HAPO可以促進(jìn)人臍靜脈來源的細(xì)胞系ECV304的粘附和遷移，并呈現(xiàn)劑量的依賴性。由于其他已經(jīng)研究的細(xì)胞或者因為技術(shù)上的難度不容易獲得或者需要依賴細(xì)胞因子生長從而代價昂貴，因此選擇ECV304細(xì)胞作為研究H

3、APO受體的靶細(xì)胞。通過生物素標(biāo)記的HAPO與ECV304細(xì)胞孵育發(fā)現(xiàn)HAPO確實可以結(jié)合在ECV304細(xì)胞上。進(jìn)一步利用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)HAPO組較對照組多了一條110KD的蛋白帶，將該條帶送到國家生物分析中心進(jìn)行質(zhì)譜測序，通過和基因庫里的序列比較發(fā)現(xiàn)該蛋白是核仁蛋白(nucleolin)。由于核仁蛋白是主要表達(dá)于核內(nèi)的蛋白質(zhì)，所以首先檢測了核仁蛋白在ECV304細(xì)胞膜上的表達(dá)。分別利用流式細(xì)胞術(shù)、提取膜蛋白的方法檢測蛋白的表達(dá)，

4、最終發(fā)現(xiàn)核仁蛋白確實表達(dá)在ECV304細(xì)胞的細(xì)胞膜上，這與已經(jīng)報道的文獻(xiàn)吻合。進(jìn)一步實驗中，利用蛋白質(zhì)overlay的方法檢測到在物理水平上HAPO與核仁蛋白確實可以互相結(jié)合?；罴?xì)胞共定位實驗進(jìn)一步證明了HAPO在活細(xì)胞的水平上也可以與核仁蛋白相結(jié)合。為了證明核仁蛋白是HAPO的功能性受體，利用核仁蛋白的抗體進(jìn)行了阻斷實驗，發(fā)現(xiàn)在有100倍摩爾濃度的核仁蛋白抗體存在的情況下，HAPO對ECV304細(xì)胞的促粘附作用受到了抑制，因此可以確定

5、表達(dá)在細(xì)胞表面的核仁蛋白是HAPO的功能性受體。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一點，構(gòu)建了pcDNA3.1-nucleolin載體，并將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞表面核仁蛋白陰性的人胚腎上皮細(xì)胞HEK293中，轉(zhuǎn)染后16小時，利用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測細(xì)胞表面的核仁蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)16小時后293細(xì)胞表面確實表達(dá)了核仁蛋白。利用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行遷移實驗，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞相比，HAPO大大促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了核仁蛋白是HAPO

6、的功能性受體。 總之，鑒定了核仁蛋白是HAPO的功能性受體，并發(fā)現(xiàn)它與HAPO的一些生物學(xué)功能相關(guān)，這值得進(jìn)行進(jìn)一步的研究以加深對HAPO生物學(xué)功能和作用機(jī)制的理解。 第二部分FAK在人白血病細(xì)胞系k562中的表達(dá)與細(xì)胞的增殖、分化細(xì)胞周期、藥物敏感性的關(guān)系 研究背景：粘附集中點激酶(FAK)是一個粘附集中點激酶(FAK)是一個非受體型的酪氨酸激酶，定位在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸的地方，即粘附集中點(focaladh

7、esion)。FAK可以協(xié)調(diào)來自整合素(integrin)、細(xì)胞因子、生長因子受體以及原癌基因的信號，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的很多活動，如：增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞周期等。FAK在多種類型的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)或持續(xù)活化，并與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、浸潤、增殖的增加有關(guān)。雖然FAK在實體瘤中的研究進(jìn)展已經(jīng)很多，但是關(guān)于FAK在正常骨髓細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的表達(dá)和作用的研究還十分少。 目的：利用Bcr-Abl陽性的慢粒細(xì)胞系k562，通過RNA干擾的方法來

8、研究FAK對慢粒白血病細(xì)胞的功能的影響。 方法：合成針對FAK序列的寡核苷酸，退火后，經(jīng)酶切連接入可以表達(dá)短發(fā)夾RNA的pGE-1載體，將載體轉(zhuǎn)染入人慢粒白血病細(xì)胞系k562中，經(jīng)G418篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞株，經(jīng)過RT-PCR、westernblot兩種方法鑒定干擾的效率。隨后采用MTT染色檢測干擾FAK表達(dá)后，k562細(xì)胞的增殖情況。采用PI染色法，通過流氏檢測和軟件計算來檢測干擾后細(xì)胞周期的變化。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和對照