基于二代測序技術(shù)對智力障礙的發(fā)病機(jī)制及診斷策略研究.pdf

1、背景:智力障礙(ID)，又稱為智力低下、精神發(fā)育遲滯(MR)、腦發(fā)育遲緩(DD)，以認(rèn)知功能和社會(huì)適應(yīng)功能的缺陷為主要臨床特征，通常在18歲前發(fā)病。腦發(fā)育遲緩豐要用于5歲以下的嬰幼兒的診斷，指患兒在適應(yīng)性、大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)、語言、個(gè)人社交五個(gè)發(fā)育能區(qū)中兩個(gè)或兩個(gè)以上發(fā)育能區(qū)較同齡兒明顯落后（≥2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）。智商(IQ)是評(píng)估認(rèn)知功能的指標(biāo)，IQ分?jǐn)?shù)低于70被視為認(rèn)知功能缺陷。智力障礙是嚴(yán)重的社會(huì)問題，群體發(fā)病率為1％-3％，男性與女性患

2、者的比例約為1.4～1.6∶1。ID臨床表現(xiàn)多樣化，認(rèn)知障礙可以是唯一的癥狀，也可伴隨其他多系統(tǒng)異常，如先天畸形及神經(jīng)系統(tǒng)異常癥狀。ID病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳岡素也有外在的環(huán)境因素，約有2/3的ID是由遺傳因素導(dǎo)致，包括各類染色體異常、單基因或多基因突變及先天性代謝缺陷病等。目前對于智力障礙的診斷主要依賴臨床表現(xiàn)與常規(guī)臨床檢驗(yàn)以及傳統(tǒng)的遺傳學(xué)檢測技術(shù)，如染色體核型分析、PCR-Sanger測序、熒光原位雜交(FISH)及多重連接探針擴(kuò)

3、增技術(shù)(MLPA);但是，仍有半數(shù)以上的ID患者未能明確病因。近年來研究顯示基因拷貝數(shù)變異（CNVs）與神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知障礙類疾病密切相關(guān)，如智力障礙及自閉癥譜系障礙;因此有研究應(yīng)用微陣列比較基因組雜交（aCGH）和單核苷酸多態(tài)性分型為基礎(chǔ)的陣列技術(shù)(SNParray)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行CNVs分析;但是該方法不能檢測無CNVs改變的其他遺傳變異，例如點(diǎn)突變。二代測序技術(shù)以高效、快速、特異、靈敏等眾多優(yōu)勢在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用飛速發(fā)展，為遺傳性

4、疾病的病因研究帶來了巨大的變革，可以檢測點(diǎn)突變、堿基的缺失或插入等;國外已有少量研究，利用二代測序技術(shù)對ID進(jìn)行病因研究，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)單基因點(diǎn)突變是導(dǎo)致智力障礙的重要原因;國內(nèi)目前僅有針對ID基因突變的個(gè)例報(bào)道，尚未見到應(yīng)用二代測序技術(shù)對大樣本ID患者進(jìn)行多基因、系統(tǒng)性發(fā)病機(jī)制研究。本研究創(chuàng)新性的利用日標(biāo)序列捕獲-二代測序技術(shù)對40例ID患者的384個(gè)ID相關(guān)基因進(jìn)行序列分析，并在拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)若干捕獲探針，檢測與智力障礙相關(guān)

5、的CNVs。由于ID的病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣化，為疾病診斷帶來困難，而國內(nèi)卻缺乏規(guī)范細(xì)致的診斷流程，迫切需要建立一個(gè)切實(shí)有效的智力障礙診斷策略。
　　目的:通過對160例智力障礙患者的病因分析，研究ID的發(fā)病機(jī)制，為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、治療與預(yù)后提供理論依據(jù)。通過對病例的綜合分析，建立一種切實(shí)有效的智力障礙診斷策略，為優(yōu)化診斷流程并提高診斷率服務(wù)。
　　方法:對160例智力障礙患者進(jìn)行詳細(xì)的病史采集、體格檢查、常規(guī)檢驗(yàn)、影像

6、學(xué)檢查及IQ值的測定，由外在環(huán)境因素導(dǎo)致的ID可初步診斷，非外在因素引起ID進(jìn)行常規(guī)遺傳學(xué)檢查(包括:染色體核型分析、遺傳代謝病篩查、脆性X綜合征三核苷酸(CGG)重復(fù)序列分析、亞端?？截悢?shù)變異分析)后仍不能明確病因者，采用目標(biāo)序列捕獲-二代測序技術(shù)對其中40例患者的384個(gè)已知智力障礙相關(guān)基因進(jìn)行深度測序，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、核苷酸的插入或缺失(InDel)分析和外顯子大片段缺失/重復(fù)分析，最終篩選出與疾病相關(guān)的

7、候選SNPs、InDels及外顯了大片段缺失/重復(fù);利用Sanger一代測序?qū)λ械暮蜻xSNPs、InDels進(jìn)行驗(yàn)證，利用MLPA技術(shù)對大片段的缺失/重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證;為了分析基因突變的來源及遺傳機(jī)制，對部分家系進(jìn)行了相關(guān)序列分析。
　　結(jié)果:通過對160例智力障礙患者的病因分析及常規(guī)遺傳學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)160例患者中，由非環(huán)境因素導(dǎo)致的ID患者84例，其中21-三體綜合征2例(2/84，2.38％)，甲基丙二酸血癥1例(1/84，1.

8、19％)，亞端?？截悢?shù)變異7例(7/84，8.33％)。采用目標(biāo)序列捕獲-二代測序技術(shù)對40例經(jīng)過常規(guī)遺傳學(xué)檢測仍未能明確診斷的ID患者進(jìn)行了384個(gè)已知智力障礙相關(guān)基因的深度測序，發(fā)現(xiàn)2例患者(2/40，5％)存在大片段拷貝數(shù)缺失，包括7q11.23和22q11.21缺失;20例患者(20/40，50％)存在致病性單基因或多基因突變，包括22個(gè)錯(cuò)義突變，2個(gè)剪切突變，2個(gè)InDel，陽性檢出率達(dá)55％;其巾23個(gè)突變?yōu)閲鴥?nèi)外首次報(bào)道的

9、新發(fā)突變，所有錯(cuò)義突變及InDels均導(dǎo)致保守的氨基酸殘基發(fā)生改變，經(jīng)SIFT、PolyPhen2軟件預(yù)測或MutationT@ster軟件預(yù)測突變潛在致病。根據(jù)ID患者的病因分析及遺傳檢測結(jié)果，總結(jié)出一套實(shí)用有效的智力障礙診斷策略，為臨床快速的病因診斷服務(wù)。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果顯示影響編碼區(qū)的單基因或多基因突變是智力障礙的常見病因;目標(biāo)序列捕獲-二代測序技術(shù)可以作為一種高效特異的檢測方法為智力障礙患者提供快速有效的病因診斷，為