美國病理學(xué)會對于二代測序臨床診斷的實驗室標(biāo)準(zhǔn)

1、美國病理學(xué)會（美國病理學(xué)會（CAP）對于二代測序臨床診斷的實驗）對于二代測序臨床診斷的實驗室標(biāo)準(zhǔn)室標(biāo)準(zhǔn)相對于桑格測序來說，二代測序的較高的通量和每個堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測領(lǐng)域。盡管在1988年美國病理學(xué)會（CAP）沒有給出這項技術(shù)在臨床診斷上的實驗室標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。但在過去的幾年，能夠提供二代測序檢測服務(wù)的實驗室相應(yīng)的不斷增加。目的：針對應(yīng)用二代測序技術(shù)的臨床診斷給出一個檢查清單用以標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作平臺和生物信息數(shù)據(jù)分析

2、平臺。因為基于NGS的臨床檢測是一個新的診斷技術(shù)，而且相對于一代測序其更為復(fù)雜，所以目前亟需針對這些檢測制定新的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。設(shè)計：針對NGS制定必要的規(guī)章制度，促進這項技術(shù)更好地應(yīng)用于臨床檢測。在2011年CAP成立了NGS工作組委員會，以對檢測清單的項目內(nèi)容進行仔細(xì)研究。結(jié)果：在CAP分子病理學(xué)檢測清單中總共包含針對實驗操作平臺和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺的18項實驗室認(rèn)證要求清單。結(jié)論：這項經(jīng)CAP委員會認(rèn)真考慮后所給的報告陳述了對于制定新

3、的檢測清單的重要性。其中包含文件、批準(zhǔn)、質(zhì)保、驗證、異常日志、監(jiān)控升級、各個版本解釋及報告、附帶的發(fā)現(xiàn)、數(shù)據(jù)儲藏、可追溯性模板、數(shù)據(jù)傳送保密性等的處理。DNA測序即二代測序技術(shù)（NGS）由七十年代的化學(xué)測序法和桑格測序法逐漸演化而來。NGS與一代測序主要的不同是其可以并行的對數(shù)以百萬的DNA短片段同時測序而非僅有一種DNA片段。在九十年代中期基于熒光毛細(xì)管凝膠電泳的自動化桑格測序的產(chǎn)生使得DNA測序普遍應(yīng)用于臨床診斷。而NGS更高的通量

4、遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自動化桑格測序。二代測序的較高的通量和每個堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測領(lǐng)域，盡管NGS各方面分析都更為復(fù)雜。包括數(shù)據(jù)獲得和儲藏的案例遠(yuǎn)超出于1988年臨床檢驗科改善后的實驗室修正案，對于后續(xù)數(shù)據(jù)計算具有較大挑戰(zhàn)性。NGS檢測的領(lǐng)域涉及遺傳病、實體瘤、惡性血液病、傳染性疾病，人類白細(xì)胞抗原分析，非侵害性產(chǎn)前診斷，胎兒染色體異常檢測。委員會認(rèn)真考慮后所給的報告陳述了對于制定新的檢測清單的重要性。另外，這份報告可以作

5、為CAPNGS檢測清單的補充，因此內(nèi)容上與2014年檢測清單需求緊密相連。NGS實驗標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件實驗標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件實驗室需要建立一個標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件。一個詳實的標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件是臨床實驗室質(zhì)量評價的主要部分。所有的DNARNA樣品準(zhǔn)備、片段化、文庫準(zhǔn)備、分子標(biāo)簽、樣品混合、合成測序相關(guān)實驗操作必須建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件，這樣才能對每一步及隨后的操作進行追蹤。這包含所有的方法、試劑、儀器、儀器軟件、之前的版本等。另外，對于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)也需

6、要進行描述。一些案例在后面重點提出。NGS靶序列實驗（例如多基因模塊或外顯子測序）可以在測序前對感興趣的基因區(qū)域進行捕獲，關(guān)于捕獲區(qū)域的詳細(xì)信息以及富集步驟都應(yīng)以文件的形式進行詳細(xì)描述。對于處理不同類型樣品的臨床實驗室，如血液、石蠟包埋的福爾馬林固定的樣本，都應(yīng)該針對不同樣品制定相應(yīng)的SOPs。用于將病人樣本合并的反應(yīng)試劑和規(guī)程必須詳細(xì)說明，并且其中應(yīng)包含測序接頭信息。用于對運行好壞的評價的質(zhì)控參數(shù)的權(quán)衡也需要文件化。常用的度量如目標(biāo)區(qū)

7、域內(nèi)Reads數(shù)的比例，質(zhì)量符合規(guī)定的堿基比例，覆蓋度的閾值，平均測序深度。實驗室必須明文規(guī)定好樣品制備和測序的接收或拒收標(biāo)準(zhǔn)。最重要的是明確和總結(jié)不能夠進行分析的區(qū)域（如測序深度不充分）。NGS實驗操作平臺驗證實驗操作平臺驗證實驗室對NGS實驗平臺進行驗證，當(dāng)有所修改變動時，要對整個流程再次進行驗證，確保流程中每一部分的表現(xiàn)符合要求?！缭诜肿釉\斷領(lǐng)域或臨床實驗室的其他領(lǐng)域，所有的實驗室研發(fā)的測試，對NGS程序性能分析必須在內(nèi)部進行

8、驗證后才可應(yīng)用于臨床。二代測序?qū)嶒炂脚_包含很多步驟，非常復(fù)雜。每一步驟應(yīng)分別根據(jù)經(jīng)驗綜合決定最佳條件和參數(shù)設(shè)置。這些東西設(shè)置好后，必須進行從開始到結(jié)束的全部測試的性能驗證，包括實驗平臺和生物信息分析平臺。在驗證期間需要確定的重要性能有分析的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度（接近真實值的程度），精確度（重復(fù)性和可靠性），檢測極限。對于任何分子實驗，針對不同的樣品類型（血液、唾液、組織），必須獨立的進行效驗。二代測序檢測是旨在對于基因組的多個大的區(qū)段