二代測序技術在t(821)AML中的應用及Ezh1促進白血病的作用研究.pdf

1、第一部分二代外顯子測序技術在t(8;21)AML的應用
　　目的:二代外顯子測序技術是腫瘤研究進展的一個里程碑，通過二代外顯子測學技術發(fā)現(xiàn)的基因突變，對了解急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)發(fā)病機制和指導治療分層有重要意義。t(8;21)(q22;q22)易位是AML中最常見的細胞遺傳學改變，t(8;21)AML易位產(chǎn)生AML1-ETO融合基因，AML1-ETO單獨表達不能引起白血病，需與其它基

2、因突變共同作用才能引起AML。相比其它類型AML，t(8;21)AML更容易發(fā)生重現(xiàn)性基因突變，因此篩選該類疾病中新的突變非常重要。根據(jù)NCCN-2015-AML-V1預后分層，t(8;21)AML或合并KIT以外突變，均預后良好;1/3的患者合并KIT突變，預后中等。但是從臨床流行病學角度分析，t(8;21)AML是一類異質性較大的白血病，原因尚不明確。因此篩選t(8;21)AML的突變基因對于未來疾病分層具有十分重要的意義。本研究目

3、的是:二代外顯子測序技術在白血病中的應用價值，發(fā)現(xiàn)初治t(8;21)AML和復發(fā)基因突變分布規(guī)律，初治和復發(fā)的克隆演變。
　　方法:我們設計的NimbleGen捕獲芯片，覆蓋了下列111個基因外顯子區(qū)域:WHO-2008年指南和NCCN-2014年指南中有關AML的突變基因，基礎研究已證實與AML相關的始動突變基因和已有芯片的所覆蓋的突變基因。部分基因覆蓋全部的外顯子區(qū)域。用Kasumi-1和SKNO-1預混不同細胞比例評估二代外

4、顯子芯片技術的檢測敏感性。NimbelGen捕獲芯片的測序平臺是Illumina Hiseq，檢測了33例t(8;21)AML骨髓樣本;用Varscan2方法，采用初治-緩解和復發(fā)-緩解配對分析策略，得到初治以及復發(fā)的突變，再根據(jù)79例正常人數(shù)據(jù)庫以及其他方式篩選得到有害性突變并篩選重現(xiàn)性突變。
　　結果:我們用Kasumi-1和K562兩種細胞系按一定比例預混后，進行敏感性分析。在1600×的深度下，3％的混合濃度下，純合突變的

5、檢出率為100％，雜合突的檢出率大于95％。分析18例t(8;21)AML突變情況，突變頻率最高的是KIT，其次是ASXL1、FLT3、KDM6A、NRAS、PHF6和RAD21-AS1。初治的基因突變包括:PHF6、KDM6A、FLT3、SH2B3、RAD21、MEF2B、IDH2、IDH1、CBL和ETV6。復發(fā)的基因突變包括:SETD2、IKZF1、FLT3-ITD。初治和復發(fā)共有的突變基因包括:KIT、RAD21-AS1、NRA

6、S、ASXL1。在18例t(8;21)AML樣本中，有3個樣本是成對的，＃1-初治合并的突變是NRAS和FLT3，＃1-復發(fā)合并的突變是FLT3-ITD;＃2-初治FLT3，＃2-復發(fā)合并的突變是NRAS和IKZF1，推測＃1和＃2患者可能存在克隆演變。＃7-初治和＃7-復發(fā)均為KIT突變，推測＃7患者的復發(fā)是原白血病主克隆復發(fā)。
　　結論:用二代白血病外顯子芯片檢測敏感性高，在t(8;21)AML中，發(fā)現(xiàn)除KIT以外的基因突變，

7、初步探索了初治和復發(fā)的基因突變，有助于分析疾病的克隆演變。
　　第二部分 Ezh1促進t(8;21)AML發(fā)病機理研究
　　目的:急性髓系白血病是一類異質性血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)生和發(fā)展與造血干細胞的成熟分化障礙、惡性克隆有關。t(8;21)(q22;q22)易位是AML中最常見的細胞遺傳學改變，其易位形成AML1-ETO融合基因，轉錄翻譯為AML1-ETO融合蛋白。盡管該類白血病均攜帶t(8;21)(q22;q22)易位，具有

8、相對均一的遺傳學背景，但該型白血病本身存在非常強的異質性。造成異質性較大的根本原因在于研究機制不清楚。表觀遺傳因素參與AML1-ETO陽性白血病發(fā)生發(fā)展:ETO募集轉錄抑制復合物N-CoR/SMRT/Sin3/HDAC，抑制下游基因的表達;AML1-ETO與其他轉錄因子(例如:CEBPα、PU.1和MEF)通過相互作用而抑制或激活下游基因的表達;PRMT1甲基化AML1-ETO9a融合蛋白142位精氨酸，促進Kasumi-1細胞中的轉錄

9、激活。乙?；疉ML1-ETO融合蛋白43位賴氨酸，促進白血病細胞的自我更新。組蛋白甲基化在該型白血病中的作用尚沒有報道。生物信息學TCGA表達譜芯片提示Ezh1(Enhancer ofzeste homolog1)在t(8;21)AML中表達高于正常核型AML，Ezh1維持造血干細胞多能性，Ezh1敲除骨髓呈衰竭狀態(tài)。揭示了Ezh1與造血系統(tǒng)的重要聯(lián)系，Ezh1在白血病中的作用尚不明確。本實驗目的是探討Ezh1與AML1-ETO的關系，

10、Ezh1在t(8;21)AML中的生物學功能。
　　方法:實時定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)檢測Ezh1的mRNA表達水平;Western blot檢測Ezh1的蛋白表達水平。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CoIP)和Western blot實驗檢測AML1-ETO和Ezh1是否相互結合。轉染siRNA沉默EZH1，流式細胞儀檢測轉染效率，克隆形成實驗檢測細胞增殖情況

11、。為了研究Ezh1在體內的功能，裸鼠皮下注射轉染空載體的SKNO-1細胞和轉染siRNA48h的SKNO-1細胞，觀察腫瘤體積、重量和白血病骨髓、肺、肝和脾浸潤情況。
　　結果:Ezh1在t(8;21)AML的細胞系和患者中mRNA和蛋白水平特異性高表達，AML1-ETO與Ezh1結合形成相互作用復合物。在Kasumi-1和SKNO-1細胞中，用siRNA沉默Ezh1的表達后克隆數(shù)目形成減少。在裸鼠成瘤實驗中，實驗組注射轉染siE

12、zh148h的SKNO-1細胞，對照組注射轉染空載體48h的SKNO-1細胞，每組6只。在成瘤速度上對照組在24天可以測到腫瘤大小，siEzh1組腫瘤在第45天可以測到腫瘤大小。siEzh1組的腫瘤體積和成瘤速度明顯小于和慢于空載組。siEzh1組vs對照組腫瘤重量:68±23mg vs262±64 mg，P＜0.05，兩組腫瘤重量有明顯差異，siEzh1組腫瘤明顯小于空載組。siEzh1組骨髓形態(tài)和病理切片，低倍鏡觀察siEzh1組白