茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝及其相關(guān)酶的基礎(chǔ)方法研究.pdf

1、L-茶氨酸是茶樹體內(nèi)特征性非蛋白質(zhì)氨基酸，自1950年日本學(xué)者Sakato Y．在綠茶提取液中發(fā)現(xiàn)并鑒定以來，人們對(duì)茶氨酸的理化性質(zhì)、代謝途徑、分離純化、合成方法、分析檢測(cè)、生物學(xué)活性及食品應(yīng)用等諸多方面開展了廣泛而深入的系統(tǒng)研究。為進(jìn)一步揭示茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝規(guī)律及生理意義，闡明各茶氨酸代謝關(guān)鍵酶在茶樹體內(nèi)的催化本質(zhì)，本課題進(jìn)行了茶氨酸代謝及其相關(guān)酶的基礎(chǔ)方法研究：（1）分析了茶氨酸的紫外光譜特征，建立了茶葉中茶氨酸HPLC-PDAD

2、檢測(cè)方法；（2）研究了茶籽苗中兒茶素類、嘌呤堿類及游離氨基酸的分布規(guī)律，從而為茶氨酸代謝酶研究提供選材依據(jù)；（3）比較了不同氮素前體和黃化處理對(duì)茶籽苗兒茶素類及茶氨酸的代謝效應(yīng)；（4）建立了一種茶葉游離氨基酸定量新方法-DNFB衍生化法；（5）實(shí)現(xiàn)了茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝前體及產(chǎn)物的HPLC同步檢測(cè)；（6）結(jié)合陽離子交換和DNFB衍生化兩種樣品預(yù)處理方法，探討了茶樹體內(nèi)茶氨酸合成酶活性HPLC檢測(cè)方法的可行性；（7）開展了茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝

3、物及其代謝酶的初步研究。
　　 本論文主要獲得如下試驗(yàn)結(jié)果：
　　 1．以0.05％（V/V）三氟乙酸和50％（V/V）乙腈為流動(dòng)相，應(yīng)用HPLC-PDAD建立了茶葉中未衍生化L-茶氨酸的分析方法。結(jié)果表明：L-茶氨酸的紫外吸收波長范圍在190-240nm之間，且在199nm具有最大吸收峰。在0.02～1.00mg/mL，范圍內(nèi)，L-茶氨酸峰面積與濃度之間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=5.8343×106X+1.82

4、01×105（r2=0.9991）。六大茶類各樣品L-茶氨酸含量RSD（％）在0.24％～1.74％之間，平均加標(biāo)回收率為99.21％～101.28％。
　　 2．應(yīng)用HPLC-PDAD和氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)4～5葉初展的福云6號(hào)沙培茶籽苗各部位兒茶素類、嘌呤堿、氨基酸（茶氨酸）進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明：兒茶素類、嘌呤堿（咖啡堿、可可堿）主要分布于茶籽苗葉片及嫩莖，子葉下部含量明顯降低；EGCG、茶氨酸在茶籽苗嫩葉中含量較高，并隨葉

5、片成熟不斷減少，但茶氨酸以側(cè)根和主根最為富集，其代謝前體氨基酸（Glu、Ala）在根部亦具較高含量。隨著茶籽萌發(fā)，茶氨酸在胚根大量合成，初露紫紅色嫩莖的茶籽苗根系茶氨酸含量達(dá)13.429mg/g鮮重。據(jù)此認(rèn)為培育茶籽及其無性系幼苗，并以幼嫩根系為材料，有望成為茶籽綜合利用及天然茶氨酸獲取的新途徑。
　　 3．以生育一致的去子葉福鼎大白茶籽苗及其非完整植株為材料，采用含不同氮素前體的MS培養(yǎng)液（不含氮素成分及CaCl2，蔗糖濃度為

6、15g/L）培養(yǎng)，結(jié)果表明：（1）子葉上部是兒茶素代謝豐要場所，不同氮素前體培養(yǎng)的茶苗植株子葉上部沒食子化兒茶素（EGC、GCG+EGCG）含量相對(duì)較高；以缺氮培養(yǎng)植株為對(duì)照，不同氮素前體培養(yǎng)2d和4d的茶籽苗子葉上部兒茶素組成及總量均發(fā)生或高或低的增減變化，完整植株兒茶素含量略高于非完整植株，但其培育過程中均呈減少趨勢(shì)。（2）茶苗植株的子葉下部茶氨酸含量顯著高于子葉上部；不同氮素前體培養(yǎng)2d或4d的完整植株子葉上部茶氨酸含量差異均低于

7、非完整植株，而子葉下部則表現(xiàn)為完整植株高于非完整植株；茶籽苗完整植株培養(yǎng)4d后，其子葉上部茶氨酸含量顯著低于培養(yǎng)2d的茶籽苗植株。自然光照和黃化處理的茶籽苗植株子葉下部L-茶氨酸含量并無太大差異；黃化處理可提高子葉上部L-茶氨酸的含量，但并不伴隨子葉上部兒茶素總量的降低。
　　 4．氨基酸的a-氨基能與2，4-二硝基氟苯（DNFB）發(fā)生衍生化反應(yīng)，本試驗(yàn)通過乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系中的氨基酸衍生物（DNP-AA），并測(cè)定其在420n

8、m的吸光值，建立了一套茶葉游離氨基酸定量新方法。該法對(duì)不同茶類分析結(jié)果與茚三酮顯色法基本一致，但具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。DNP-AA的吸光值（Y）和氨基酸濃度（X）的回歸方程分別為L-茶氨酸：Y=0.9920X+0.0036（r2=0.9998）和L-谷氨酸：Y=0.9403X-0.0008（r2=0.9995），線性范圍為0.02～1.00mg/mL。衍生化反應(yīng)體系：1.0mL茶樣浸提液，1.0mL0.2mol/L NaHCO3，1

9、.0mL1％（V/V）DNFB-二氧六環(huán)溶液，充分混勻后，于60℃水浴加熱，暗處密閉反應(yīng)40min，加入0.5mL1mol/L HC1終止反應(yīng)。在該反應(yīng)條件下，紅茶、綠茶、烏龍茶、黃茶、白茶和黑茶的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為99.194％～101.250％和0.507％～1.299％（L-茶氨酸）、98.947％～101.840％和0.500％～1.271％（L-谷氨酸）。
　　 5．L-丙氨酸、乙胺、L-谷氨

10、酸及L-茶氨酸是茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝途徑的主要前體或產(chǎn)物，其在茶樹體內(nèi)的分布及變化和參與其代謝的相關(guān)酶類緊密聯(lián)系。本試驗(yàn)以2，4-二硝基氟苯（DNFB）為衍生化試劑，應(yīng)用RP-HPLC對(duì)成品茶及茶樹鮮組織中茶氨酸代謝物進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明：L-丙氨酸、乙胺（鹽酸乙胺）、L-谷氨酸及L-茶氨酸衍生化產(chǎn)物吸收波長范圍在300～500nm之間，且各標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.005～0.5mg/mL）與衍生化產(chǎn)物的吸收峰面積具有良好的線性關(guān)系（λ=36

11、0nm）；該法適用于成品茶及茶樹鮮組織中茶氨酸代謝前體及產(chǎn)物的同步檢測(cè)，并可獲得準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。六大茶類各待測(cè)組分以白茶、綠茶、紅茶中的L-茶氨酸含量相對(duì)較高，而在黑茶中儀檢出少量乙胺；L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-茶氨酸在茶籽苗中的含量及分布具有明顯的季節(jié)性變化，但乙胺在茶樹根系及芽葉均保持在含量較低的代謝水平。
　　 6．茶氨酸合成酶是茶樹體內(nèi)茶氨酸合成代謝的關(guān)鍵酶。由于其體外催化體系成分復(fù)雜，本課題依據(jù)L-茶氨酸理化性質(zhì)

12、，對(duì)茶氨酸合成酶活性HPLC檢測(cè)法進(jìn)行了可行性探討，結(jié)果表明酶促反應(yīng)混合體系經(jīng)732陽離子交換樹脂或2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化預(yù)處理，結(jié)合RP-HPLC檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)酶促產(chǎn)物（L-茶氨酸）的準(zhǔn)確定量。去子葉茶籽幼苗（福云6號(hào)）和一芽二葉新梢（龍井43）的丙酮粉提取粗酶液可檢出微弱的茶氨酸合成酶催化活性，但茶樹組織茶氨酸去除、茶氨酸合成粗酶液的制備及其體外最適催化體系尚待深入研究。
　　 7．直接或間接參與茶氨酸代謝途徑的酶

13、類有L-茶氨酸合成酶、L-茶氨酸水解酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、L-丙氨酸脫羧酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-a-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（亦稱谷氨酸合成酶）、胺氧化酶。本課題應(yīng)用2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化-HPLC檢測(cè)法，對(duì)茶籽幼苗（去子葉）、一芽二葉新梢及茶籽苗子葉的茶氨酸代謝物進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明各茶組織以L-茶氨酸含量最高，其次為L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，乙胺和L-丙氨酸含量較低。茶氨酸代謝酶活性檢測(cè)結(jié)果表明：一芽二葉新