茶氨酸合成相關基因RNAi載體的構建及茶樹遺傳轉化研究.pdf

1、茶氨酸為茶樹特有的非蛋白質氨基酸,催化其合成的關鍵酶尚未研究清楚。RNAi是雙鏈RNA的衍生復合物誘導同源基因mRNA降解的轉錄后基因沉默技術。在本實驗室構建的茶樹幼根cDNA文庫中,獲得GS1-1基因(contig47)的EST序列,通過實時熒光定量PCR技術驗證該基因可能與茶氨酸合成相關。利用GS1-1基因的3’-UTR及其鄰近區(qū)域構建RNAi載體進行茶樹葉片遺傳轉化,以期進一步解釋茶氨酸生物合成機制。主要結論如下:
　　1、

2、茶氨酸合成相關基因GS1-1的RNAi載體構建。在本實驗室獲得茶氨酸合成相關基因GS1-1的EST序列的基礎上,通過SMARTRACE技術獲得其3’-端全長序列。選取3’-UTR及其鄰近區(qū)一段長350bp序列為干涉的目的片段,再從載體pJawohl8上選取一段大小為500bp的內含子序列(茶基因組內無)為填充片段,運用―零背景克隆‖技術構建出―發(fā)夾‖結構,通過驗證該結構正確。將其重組到植物表達載體pCAMBIA2301上,轉化到農(nóng)桿菌E

3、HA105中,成功構建出RNAi載體pCAM-RNAi-GS。
　　2、龍井-43葉片愈傷誘導最佳激素濃度及抗生素濃度篩選的研究。由于茶樹再生困難,選取龍井43葉片作為遺傳轉化受體材料。葉片在1/4MS+TDZ0.1μmol·L-1+IBA0.49μmol·L-1+2,4-D0.005mg·L-1的培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d后,愈傷組織誘導率最高達96％。將葉片置于含不同濃度卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得龍井-43的卡那霉素抗性標記篩選濃度

4、為100mg·L-1。
　　3、根癌農(nóng)桿菌介導轉化龍井43葉片。以龍井43葉片為受體材料,預培養(yǎng)3d后用活化的農(nóng)桿菌EHA105(含RNAi載體pCAM-RNAi-GS)侵染15min,置于YMB培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4d,脫菌后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得8塊抗性愈傷組織。經(jīng)GUS組織化學染色和PCR檢測驗證其中3塊(愈傷-4,愈傷-5,愈傷-6)為陽性結果。利用0.05%的三氟乙酸做流動相,高效液相色譜法(HPLC)測定抗性愈傷組織內茶