抗腫瘤候選新藥CAT體內代謝及其藥物代謝組學的LC-MS-MS分析方法研究.pdf

1、本論文探索并建立了基于RRLC-MS/MS技術的快速發(fā)現(xiàn)與識別藥物原型成分和代謝產物的整合性分析方法，并采用該方法開展了抗腫瘤候選新藥S-(+)-去氧娃兒藤寧堿(CAT)在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠中的代謝特異性及其代謝產物分析研究，在此基礎上進一步開展了CAT的藥物代謝組學方法研究，旨在獲得與CAT藥效作用和毒性作用相關的內源性代謝物。通過抗腫瘤候選新藥CAT的體內代謝研究，在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了21個代謝產物及藥物原型，并

2、尋找到在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠中具有明顯差異的1個特異性代謝產物。此外，在藥物代謝組學研究中，以動物體征變化趨勢為依據，考察藥物引起的內源性代謝物變化信息，篩選出3個與CAT藥效作用相關的內源性代謝物和2個與CAT毒性作用相關的內源性代謝物。通過上述研究，獲得了抗腫瘤候選藥物CAT在正常與腫瘤模型大鼠中代謝差異及其差異代謝產物，以及與藥物毒性、藥效作用相關的內源性代謝物信息，為抗腫瘤新藥CAT的成功研發(fā)獲得了關鍵的體內

3、代謝轉化信息，并為其作用機制研究提供了有效依據。
　　 本論文的研究內容主要包括以下4個部分：
　　 1.基于RRLC-MS/MS技術的藥物體內代謝產物整合性分析方法研究
　　 本研究基于RRLC-MS/MS技術，將能量相關二級質譜掃描(MSE)與多時間段子離子掃描（mpMS/MS）掃描方式以及數據挖掘方法有效整合起來，建立了一種快速發(fā)現(xiàn)與識別藥物原型成分和代謝產物的新型整合性分析方法。本分析方法采用MSE與mp

4、MS/MS相結合的質譜數據采集方式，并采用特征離子精確質量數提取(hcXIC)方法進行數據挖掘，實現(xiàn)了從復雜生物樣本中全面、快速地篩查出藥物原型成分和代謝產物的目的。其中，非目標性掃描模式MSE可用一個“普適性”方法對多個目標化合物進行同步分析，保證方法的高通量和高效性；而目標性掃描方式mpMS/MS對MSE發(fā)現(xiàn)的可能代謝產物進行進一步識別與驗證，保證方法的專屬性和靈敏度。mpMS/MS與MSE模式的整合可形成優(yōu)勢互補、相輔相成的分析手

5、段，即MSE為mpMS/MS提供保留時間和分子量信息，有助于實現(xiàn)其高通量；而mpMS/MS則解決了MSE共流出組分干擾的問題。此外，hcXIC數據處理方法采用精確質量數與特征離子相結合的雙重過濾數據挖掘模式，能夠有效去除內源性物質的干擾，快速篩查出藥物代謝產物，尤其利于痕量代謝產物的發(fā)現(xiàn)。
　　 2．抗腫瘤候選新藥CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的代謝特異性研究
　　 本研究采用上述整合性RRLC-

6、MS/MS分析方法，開展了抗腫瘤候選新藥CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的代謝特異性研究。通過系統(tǒng)考察CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠的代謝差異以及不同給藥劑量下代謝產物的變化情況，尋找CAT在腫瘤模型大鼠中的特異性代謝產物。研究發(fā)現(xiàn)CAT在大鼠體內不穩(wěn)定，容易轉化為代謝產物形式，在大鼠尿液中共發(fā)現(xiàn)了21個代謝產物及藥物原型，其中包括9個Ⅰ相代謝產物和12個Ⅱ相代謝產物。進一步根據菲駢吲哚里西啶生物

7、堿的質譜裂解規(guī)律和代謝產物的MS/MS譜分析，分析推導出9個代謝產物的可能結構，并結合NMR數據進行驗證與確認，最終確定了3個代謝產物的結構。此外，在高、中、低不同給藥劑量下，發(fā)現(xiàn)正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的藥物代謝產物的含量隨著CAT給藥劑量的增加而升高。通過對CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中代謝產物的比較分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝產物M10在腫瘤模型大鼠尿液中的含量明顯高于正常大鼠，對此結果進行考察

8、與分析，提出產生這種差異的原因可能是腫瘤形成過程中大鼠體內生物環(huán)境發(fā)生變化所致。
　　 3．基于Walker256腫瘤模型的代謝組學研究
　　 本研究基于前期建立的代謝組學分析方法，并且為了使不同樣品之間具有可比性，采用更加合理的峰面積歸一化與尿液體積相結合的數據校正方法，并利用多變量統(tǒng)計分析和內源性小分子代謝物的動態(tài)變化趨勢信息，開展了大鼠Walker256腫瘤的代謝組學研究，結果共獲得了29個與Walker256腫瘤

9、發(fā)展緊密相關的生物標志物。然后通過高分辨MS譜和MS/MS譜數據分析推斷其結構，并結合代謝物數據庫檢索、標準品比對等手段對鑒定結果進行確認。截止目前共鑒定出其中7個生物標志物的結構，包括L-肉堿和乙酰肉堿、胞苷、2′-脫氧胞苷、次黃嘌呤、尿刊酸和肌酸。
　　 4．抗腫瘤候選新藥CAT的藥物代謝組學研究
　　 目前藥物療效和毒性評價多使用生理、生化指標等方法，它們可以反映藥物作用的結果，但是難以確定藥物在體內的作用過程，以

10、及藥物結構與藥效及毒性作用的明確關系。因此，有必要建立一種藥物體內整體分析的新方法，考察藥物引起的內源性代謝物的變化動態(tài)，并為藥物的藥效及毒性的預測提供物質基礎。本研究通過動物體征變化考察藥物的藥效及毒性作用，采用代謝組學的研究思路分析藥物引起的內源性代謝物的變化差異，然后將動物體征變化與代謝物變化進行關聯(lián)性研究，尋找與藥物毒性作用和藥效作用有關的內源性代謝物。首先，通過對正常大鼠和Walker256腫瘤模型大鼠的體重、存活期等體征進行

11、分析考察，結果表明CAT在正常大鼠中僅表現(xiàn)為毒性作用，并且具有劑量依賴性；而在腫瘤模型大鼠中表現(xiàn)為藥效和毒性雙重作用，其中低、中劑量的CAT在大鼠體內藥效作用大于毒性作用，高劑量的CAT在大鼠體內毒性大于藥效作用。其次，采用多變量數據處理方法，開展了正常大鼠高、中、低劑量給藥組與對照組之間內源性代謝物的差異分析，并結合大鼠體征變化，獲得了2個與CAT毒性相關的內源性代謝物；采用相同的方法對Walker256腫瘤模型大鼠高、中、低劑量給藥