抗腫瘤候選新藥CAT體內(nèi)代謝及其藥物代謝組學(xué)的LC-MS-MS分析方法研究.pdf

1、本論文探索并建立了基于RRLC-MS/MS技術(shù)的快速發(fā)現(xiàn)與識別藥物原型成分和代謝產(chǎn)物的整合性分析方法，并采用該方法開展了抗腫瘤候選新藥S-(+)-去氧娃兒藤寧堿(CAT)在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠中的代謝特異性及其代謝產(chǎn)物分析研究，在此基礎(chǔ)上進一步開展了CAT的藥物代謝組學(xué)方法研究，旨在獲得與CAT藥效作用和毒性作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物。通過抗腫瘤候選新藥CAT的體內(nèi)代謝研究，在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了21個代謝產(chǎn)物及藥物原型，并

2、尋找到在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠中具有明顯差異的1個特異性代謝產(chǎn)物。此外，在藥物代謝組學(xué)研究中，以動物體征變化趨勢為依據(jù)，考察藥物引起的內(nèi)源性代謝物變化信息，篩選出3個與CAT藥效作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物和2個與CAT毒性作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物。通過上述研究，獲得了抗腫瘤候選藥物CAT在正常與腫瘤模型大鼠中代謝差異及其差異代謝產(chǎn)物，以及與藥物毒性、藥效作用相關(guān)的內(nèi)源性代謝物信息，為抗腫瘤新藥CAT的成功研發(fā)獲得了關(guān)鍵的體內(nèi)

3、代謝轉(zhuǎn)化信息，并為其作用機制研究提供了有效依據(jù)。
　　 本論文的研究內(nèi)容主要包括以下4個部分：
　　 1.基于RRLC-MS/MS技術(shù)的藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物整合性分析方法研究
　　 本研究基于RRLC-MS/MS技術(shù)，將能量相關(guān)二級質(zhì)譜掃描(MSE)與多時間段子離子掃描（mpMS/MS）掃描方式以及數(shù)據(jù)挖掘方法有效整合起來，建立了一種快速發(fā)現(xiàn)與識別藥物原型成分和代謝產(chǎn)物的新型整合性分析方法。本分析方法采用MSE與mp

4、MS/MS相結(jié)合的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式，并采用特征離子精確質(zhì)量數(shù)提取(hcXIC)方法進行數(shù)據(jù)挖掘，實現(xiàn)了從復(fù)雜生物樣本中全面、快速地篩查出藥物原型成分和代謝產(chǎn)物的目的。其中，非目標性掃描模式MSE可用一個“普適性”方法對多個目標化合物進行同步分析，保證方法的高通量和高效性；而目標性掃描方式mpMS/MS對MSE發(fā)現(xiàn)的可能代謝產(chǎn)物進行進一步識別與驗證，保證方法的專屬性和靈敏度。mpMS/MS與MSE模式的整合可形成優(yōu)勢互補、相輔相成的分析手

5、段，即MSE為mpMS/MS提供保留時間和分子量信息，有助于實現(xiàn)其高通量；而mpMS/MS則解決了MSE共流出組分干擾的問題。此外，hcXIC數(shù)據(jù)處理方法采用精確質(zhì)量數(shù)與特征離子相結(jié)合的雙重過濾數(shù)據(jù)挖掘模式，能夠有效去除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，快速篩查出藥物代謝產(chǎn)物，尤其利于痕量代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。
　　 2．抗腫瘤候選新藥CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的代謝特異性研究
　　 本研究采用上述整合性RRLC-

6、MS/MS分析方法，開展了抗腫瘤候選新藥CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的代謝特異性研究。通過系統(tǒng)考察CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠的代謝差異以及不同給藥劑量下代謝產(chǎn)物的變化情況，尋找CAT在腫瘤模型大鼠中的特異性代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)CAT在大鼠體內(nèi)不穩(wěn)定，容易轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物形式，在大鼠尿液中共發(fā)現(xiàn)了21個代謝產(chǎn)物及藥物原型，其中包括9個Ⅰ相代謝產(chǎn)物和12個Ⅱ相代謝產(chǎn)物。進一步根據(jù)菲駢吲哚里西啶生物

7、堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律和代謝產(chǎn)物的MS/MS譜分析，分析推導(dǎo)出9個代謝產(chǎn)物的可能結(jié)構(gòu)，并結(jié)合NMR數(shù)據(jù)進行驗證與確認，最終確定了3個代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。此外，在高、中、低不同給藥劑量下，發(fā)現(xiàn)正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中的藥物代謝產(chǎn)物的含量隨著CAT給藥劑量的增加而升高。通過對CAT在正常大鼠與Walker256腫瘤模型大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的比較分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝產(chǎn)物M10在腫瘤模型大鼠尿液中的含量明顯高于正常大鼠，對此結(jié)果進行考察

8、與分析，提出產(chǎn)生這種差異的原因可能是腫瘤形成過程中大鼠體內(nèi)生物環(huán)境發(fā)生變化所致。
　　 3．基于Walker256腫瘤模型的代謝組學(xué)研究
　　 本研究基于前期建立的代謝組學(xué)分析方法，并且為了使不同樣品之間具有可比性，采用更加合理的峰面積歸一化與尿液體積相結(jié)合的數(shù)據(jù)校正方法，并利用多變量統(tǒng)計分析和內(nèi)源性小分子代謝物的動態(tài)變化趨勢信息，開展了大鼠Walker256腫瘤的代謝組學(xué)研究，結(jié)果共獲得了29個與Walker256腫瘤

9、發(fā)展緊密相關(guān)的生物標志物。然后通過高分辨MS譜和MS/MS譜數(shù)據(jù)分析推斷其結(jié)構(gòu)，并結(jié)合代謝物數(shù)據(jù)庫檢索、標準品比對等手段對鑒定結(jié)果進行確認。截止目前共鑒定出其中7個生物標志物的結(jié)構(gòu)，包括L-肉堿和乙酰肉堿、胞苷、2′-脫氧胞苷、次黃嘌呤、尿刊酸和肌酸。
　　 4．抗腫瘤候選新藥CAT的藥物代謝組學(xué)研究
　　 目前藥物療效和毒性評價多使用生理、生化指標等方法，它們可以反映藥物作用的結(jié)果，但是難以確定藥物在體內(nèi)的作用過程，以

10、及藥物結(jié)構(gòu)與藥效及毒性作用的明確關(guān)系。因此，有必要建立一種藥物體內(nèi)整體分析的新方法，考察藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化動態(tài)，并為藥物的藥效及毒性的預(yù)測提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究通過動物體征變化考察藥物的藥效及毒性作用，采用代謝組學(xué)的研究思路分析藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化差異，然后將動物體征變化與代謝物變化進行關(guān)聯(lián)性研究，尋找與藥物毒性作用和藥效作用有關(guān)的內(nèi)源性代謝物。首先，通過對正常大鼠和Walker256腫瘤模型大鼠的體重、存活期等體征進行

11、分析考察，結(jié)果表明CAT在正常大鼠中僅表現(xiàn)為毒性作用，并且具有劑量依賴性；而在腫瘤模型大鼠中表現(xiàn)為藥效和毒性雙重作用，其中低、中劑量的CAT在大鼠體內(nèi)藥效作用大于毒性作用，高劑量的CAT在大鼠體內(nèi)毒性大于藥效作用。其次，采用多變量數(shù)據(jù)處理方法，開展了正常大鼠高、中、低劑量給藥組與對照組之間內(nèi)源性代謝物的差異分析，并結(jié)合大鼠體征變化，獲得了2個與CAT毒性相關(guān)的內(nèi)源性代謝物；采用相同的方法對Walker256腫瘤模型大鼠高、中、低劑量給藥