茶氨酸合成相關(guān)酶基因的克隆與“新高”梨增殖體系的建立.pdf

1、茶氨酸（又稱 N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，簡(jiǎn)稱 Theanine）是茶中特有的氨基酸，不僅影響著茶的滋味，而且還具有重要的生物活性，如降血壓、抗癌、增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效、保護(hù)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜安神、提高學(xué)習(xí)和記憶能力和抗疲勞的功效。本試驗(yàn)克隆了茶氨酸合成相關(guān)的酶基因，同時(shí)建立了“新高”梨的增殖體系，為人工培育茶氨酸梨提供研究基礎(chǔ)。
　　 1、本試驗(yàn)利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增茶氨酸合成相關(guān)酶基因的3’端，設(shè)定了如下擴(kuò)增體系：模板cD

2、NA100ng，1 0×Buffer(Mg 2+p lus)5μl，2.5mmol/L dNTPs 8μl，10μmol/L 特異性引物GSP47-1（第二輪為GSP47-2）
　　 1μl、10μmol/L 接頭引物UPM（第二輪為NUP）1 μl，L Ataq DNA聚合酶2.5U，總體積50μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋? 4℃ 3min；94℃ 30s；70℃ 45s；72℃ 80s，14個(gè)循環(huán)，-0.5℃/cycle；94℃ 30

3、s；63℃ 45s；72℃80s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。在此基礎(chǔ)上克隆出長度約為2.4kb的序列。將該序列與GenBank 上已知序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與葡萄的谷氨酸氨連接酶的核苷酸序列的相似度達(dá)81％。
　　 2、反向PCR技術(shù)（IPCR）是對(duì)已知序列DNA的兩側(cè)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究的方法。本試驗(yàn)應(yīng)用IPCR方法克隆茶氨酸合成相關(guān)酶基因的啟動(dòng)子序列：即20μl反應(yīng)液中包含1μg模板、5U 限制性內(nèi)切酶Bsp1407，2

4、μl 10×T buffer，2μl 0.1％BSA；
　　 酶切產(chǎn)物環(huán)化自連體系：50μl 體系中0.5μg 單酶切基因組DNA，5μl 10×T4 連接緩沖液、5U T4DNA連接酶，22℃連接過夜；IPCR反應(yīng)體系：50μl 體系中約50 ng 環(huán)化自連接產(chǎn)物、2.5μl 10×PCRBuffer、25mmol/L Mg 2+5μl、10mmol/L dNTPs 1μl，10μmol/L 引物對(duì)(第一輪1S1-1S2，第二

5、輪2S1-2S2)各2ul、1U Taq 聚合酶。IPCR擴(kuò)增程式為：94℃ 3min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1min，循環(huán)29 次；72℃延伸7min。利用建立的IPCR技術(shù)克隆出茶氨酸合成酶基因5’上游長度為171bp的啟動(dòng)子序列，且該序列含有TATA-box，該元件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的正確起始起著重要的作用。
　　 3、本試驗(yàn)以‘新高’梨芽為外植體，研究了不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其離體增殖的影響。結(jié)果表明