IGF1在綿羊成肌細(xì)胞增殖與分化中的作用.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor-1,IGF1)因其結(jié)構(gòu)與胰島素類似而得名。IGF1能有效促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)同時(shí)增強(qiáng)再生肌肉的收縮力,而且能夠激活RNA聚合酶等活性,促進(jìn)非組蛋白的磷酸化,提高mRNA水平,從而刺激RNA和DNA的合成,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),推動(dòng)細(xì)胞依次經(jīng)歷細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期。IGF1如何影響綿羊成肌細(xì)胞的機(jī)制目前仍不十分清楚,本研究通過(guò)分析 IGF1在綿羊成肌細(xì)胞增殖和分化中的作用探討IGF

2、1促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
　　本研究克隆了綿羊IGF1基因,將其與慢病毒表達(dá)載體(pLEX-mcs)連接,構(gòu)建了IGF1真核表達(dá)載體,建立了IGFI穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的綿羊成肌細(xì)胞系,采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫熒光進(jìn)一步分析了在過(guò)表達(dá)情況下 IGF1對(duì)綿羊成肌細(xì)胞增殖分化的影響。同時(shí),通過(guò)RT-PCR、Realtime PCR檢測(cè)了過(guò)表達(dá)IGF1綿羊成肌細(xì)胞中與增殖和分化相關(guān)基因的表達(dá)變化,從細(xì)胞水平探討了IGF1對(duì)綿羊成肌

3、細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制。本研究獲得主要數(shù)據(jù)和結(jié)果如下:
　　1、克隆了518bp綿羊 IGF1全長(zhǎng)編碼區(qū)序列并在綿羊成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá) IGF1, Western blotting檢測(cè)顯示,IGF1在綿羊原代成肌細(xì)胞中獲得表達(dá)。
　　2、利用差速貼壁法從胎羊肌肉組織中分離培養(yǎng)了成肌細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞純化和鑒定,獲得了>90％高純度的綿羊成肌細(xì)胞系。
　　3、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示穩(wěn)定表達(dá)IGF1的成肌細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著加快(

4、第1天差異顯著(P<0.05),第2-6天差異極顯著(P<0.01))。IGF1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞繪制的生長(zhǎng)曲線結(jié)果與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相吻合;細(xì)胞周期測(cè)定顯示穩(wěn)定表達(dá) IGF1的成肌細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞較早進(jìn)入S期,且在S期細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照細(xì)胞增加7.77%,并且上調(diào)了IGF1R、Akt1基因的表達(dá)。該結(jié)果與生長(zhǎng)曲線結(jié)果相符。上述結(jié)果說(shuō)明,IGF1有促進(jìn)綿羊成肌細(xì)胞增殖的作用。
　　4、MyHC免疫熒光測(cè)定細(xì)胞融合率及肌管直徑結(jié)果顯示,IGF1過(guò)表

5、達(dá)細(xì)胞系肌管融合率和肌管直徑分別為30.96%和55.29μm,相比對(duì)照細(xì)胞系的12.26%和25.86μm有顯著增加,其融合率提高了60.4%,直徑高出近一倍,并且上調(diào)了分化調(diào)控關(guān)鍵基因MyoD、Myogenin的表達(dá)。在加入MSTN的情況下,IGF1轉(zhuǎn)化細(xì)胞的肌管融合率和直徑分別為10.43%和31.92μm,而對(duì)照組細(xì)胞肌管融合率和直徑分別為6.09%和23.27μm,差異均顯著(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明在MSTN存在的情況下,