牙囊細(xì)胞通過RUNX2-MiR-31-SATB2環(huán)路調(diào)節(jié)牙萌出的機(jī)制研究.pdf

1、顱骨鎖骨發(fā)育不全(CCD)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，致病機(jī)理主要是位于第6染色體p21位的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)基因突變，導(dǎo)致RUNX2單倍劑量不足，臨床主要表現(xiàn)為骨骼發(fā)育不良和牙齒遲萌、阻生等。研究表明，CCD患者RUNX2單倍劑量不足可能會導(dǎo)致牙囊介導(dǎo)的成骨—破骨調(diào)節(jié)平衡紊亂。RUNX2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)microRNA-31(miR-31)的表達(dá)，而miR-31的下游調(diào)節(jié)因子SATB2與RUNX2存在調(diào)節(jié)關(guān)系

2、，因此，存在RUNX2-miR-31-SATB2間的生理性調(diào)節(jié)環(huán)路，但是否參與牙囊細(xì)胞調(diào)節(jié)的牙萌出機(jī)制尚不清楚。本研究分為三個部分：
　　第一部分：顱骨鎖骨發(fā)育不全患者牙囊細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性。
　　目的：體外分離并培養(yǎng)CCD患者及正常同齡對照組的牙囊細(xì)胞(dentalfollicle cells, DFCs)，并對DFCs的生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析。
　　方法：利用牙囊組織塊貼壁法體外提取并培養(yǎng)DFCs，待細(xì)

3、胞自組織塊中爬出，形成集落并且當(dāng)各集落相互接觸時進(jìn)行傳代培養(yǎng);通過細(xì)胞免疫熒光鑒定DFCs;采用用結(jié)晶紫染液染色培養(yǎng)12 d的兩種DFCs，分析其克隆形成能力;MTT法與BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析CCD患者及正常同齡對照DFCs的增殖能力;并用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)兩種DFCs成骨分化，Western blot和茜素紅染色法分析成骨能力;實(shí)時定量PCR分析破骨激活因子基因表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴CCD患者的DFCs(DFCs-CCD)與正常DF

4、Cs(DFCs)無明顯的形態(tài)學(xué)差異，兩者的Vimentin均為陽性表達(dá)，上皮標(biāo)記物Cytokeratin均陰性表達(dá)。⑵DFCs-CCD的克隆集落多于DFCs，MTT實(shí)驗(yàn)中，同一時間點(diǎn)DFCs-CCD的吸光度值高于DFCs，DFCs-CCD的BrdU陽性率高于DFCs。⑶與正常DFCs相比，DFCs-CCD中RUNX2、Osterix、骨鈣素(osteocalcin，Ocn)等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平低，且形成鈣化結(jié)節(jié)少。⑷DFCs-CCD高

5、表達(dá)核因子-κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)等破骨抑制相關(guān)因子(P＜0.05)，而RANK配體(receptoractivator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：與DFCs相比，DFCs-CCD具有更強(qiáng)的增殖、克隆形成

6、能力，但成骨分化能力較弱，破骨活性抑制因子高表達(dá)。
　　第二部分：RUNX2-miR-31-SATB2調(diào)控牙囊細(xì)胞參與牙萌出的機(jī)制。
　　目的：分析RUNX2-miR-31-SATB2環(huán)路對牙囊細(xì)胞侵襲、破骨細(xì)胞激活功能的影響，探討該環(huán)路參與牙囊細(xì)胞調(diào)控牙萌出的機(jī)制。
　　方法：⑴Western blot、Real-time PCR檢測RUNX2、SATB2、miR-31在DFCs、DFCs-CCD中的表達(dá)差異。⑵Tr

7、answell穿膜實(shí)驗(yàn)比較侵襲能力，并用Western blot及明膠酶譜檢測其MMP9、MMP2表達(dá)。⑶Real-time PCR檢測破骨激活因子表達(dá)，并通過牙囊細(xì)胞-骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨，檢測其誘導(dǎo)破骨能力差異。⑷通過敲減DFCs-CCD的miR-31表達(dá)，檢測其RUNX2、SATB2表達(dá)變化及誘導(dǎo)破骨能力的改變;通過過表達(dá)DFCs的miR-31，反向驗(yàn)證RUNX2、SATB2及誘導(dǎo)破骨能力的改變。
　　結(jié)果：①與DFCs相

8、比，DFCs-CCD中RUNX2、SATB2低表達(dá)，而miR-31高表達(dá)。②DFCs-CCD穿膜侵襲能力較弱，且MMP9、MMP2表達(dá)及活性較低。③DFCs-CCD的破骨激活因子表達(dá)、誘導(dǎo)破骨能力均較正常DFCs低。④DFCs-CCD敲減miR-31，可以逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果;相反， DFCs過表達(dá)miR-31，獲得與DFCs-CCD相似的結(jié)果。
　　結(jié)論：CCD患者RUNX2基因突變導(dǎo)致其表達(dá)下降，進(jìn)而導(dǎo)致miR-31表達(dá)升高及其靶基因

9、SATB2表達(dá)下調(diào)，RUNX2-miR-31-SATB2可能參與CCD患者恒牙遲萌，操縱RUNX2-miR-31-SATB2環(huán)路有可能促進(jìn)牙萌出。
　　第三部分：RUNX2-miR-31-SATB2環(huán)路參與牙萌出的動物實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：通過新生小鼠體內(nèi)干擾RUNX2表達(dá)，探討RUNX2-miR-31-SATB2對牙萌出的影響。
　　方法：對出生當(dāng)日的C57BL/6J小鼠注射體內(nèi)RUNX2干擾試劑，對實(shí)驗(yàn)第8天的小鼠

10、下頜骨標(biāo)本行免疫熒光檢測RUNX2表達(dá);TRAP染色檢測牙囊周圍活性破骨細(xì)胞;并提取牙囊組織的蛋白及RNA，分別檢測RUNX2、SATB2蛋白及miR-31表達(dá)。對實(shí)驗(yàn)第14天的小鼠行microCT檢測，觀察其牙齒萌出情況。
　　結(jié)果：⑴體內(nèi)干擾RUNX2第8天后，牙囊組織中RUNX2及SATB2表達(dá)均低于對照組，而miR-31表達(dá)升高。⑵實(shí)驗(yàn)組牙囊周圍牙槽骨中的破骨細(xì)胞明顯少于對照組。⑶體內(nèi)干擾RUNX2第14天后，microC