miR-X-miR-2861表達(dá)簇與轉(zhuǎn)錄因子Runx2調(diào)控環(huán)路在成骨細(xì)胞分化中的功能研究.pdf

1、第一部分一個(gè)新型小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)miRNA的克隆及表達(dá)模式分析
　　 目的:探尋新的小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)的微小核糖核酸(microRNA,miRNA),并研究其在小鼠不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)模式。
　　 方法:提取小鼠成骨細(xì)胞小分子RNA,經(jīng)Poly(A)加尾、連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收PCR產(chǎn)物后連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建cDNA文庫(kù),進(jìn)行菌落PCR,陽(yáng)性克隆測(cè)序后選取19-26 n

2、t大小的RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析確定新的miRNAs。通過(guò)Northern blot檢測(cè)新的miRNA在小鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨組織、肝臟、心臟、腎臟、肺、脾、大腦、脂肪及骨骼肌的表達(dá),并進(jìn)一步檢測(cè)其在BMP-2誘導(dǎo)的小鼠基質(zhì)細(xì)胞ST2成骨分化過(guò)程中的表達(dá)模式。
　　 結(jié)果:(1)共克隆得到162個(gè)小分子RNA序列,68個(gè)為miRNA分子,明確2個(gè)為新克隆的miRNA,其中一個(gè)命名為miR-X,其在小鼠與人類(lèi)之間具有保守性,位

3、于小鼠第二染色體。(2)miR-X在小鼠成骨細(xì)胞、骨組織及肝臟中均有表達(dá),其中成骨細(xì)胞中表達(dá)最高,其他組織及破骨細(xì)胞不表達(dá)。(3)在BMP-2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞成骨分化過(guò)程中,miR-X隨時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量不斷增加。
　　 結(jié)論:通過(guò)構(gòu)建小鼠成骨細(xì)胞小分子RNA的cDNA文庫(kù)的方法,新克隆了一個(gè)在小鼠與人類(lèi)存在保守性的新miRNA-miR-X。miR-X在小鼠成骨細(xì)胞、骨組織、肝臟中表達(dá),其中成骨細(xì)胞中表達(dá)最高,并且在小鼠成骨細(xì)胞分

4、化過(guò)程中的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)特性。
　　 第二部分 miR-X對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響及預(yù)測(cè)和鑒定其靶基因的研究
　　 目的:研究miR-X在小鼠基質(zhì)細(xì)胞ST2成骨分化中的作用并預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-X的靶基因。
　　 方法:根據(jù)miR-X前體序列設(shè)計(jì)引物,經(jīng)退火處理后與線(xiàn)性化的pSilencer4.1CMV puro載體連接,構(gòu)建miR-X表達(dá)載體pre-miR-X。將pre-miR-X或2'-O-methyl修飾的反

5、義寡核苷酸anti-miR-X分別轉(zhuǎn)染BMP-2誘導(dǎo)分化的ST2細(xì)胞(300ng/ml),造成miR-X在成骨分化過(guò)程中的過(guò)表達(dá)或功能抑制。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,采用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)硝基苯酚釋放來(lái)反映堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,放射免疫測(cè)定法測(cè)定骨鈣素(osteocalcin,OC)分泌,采用Westernblot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt relatedtranscr

6、iption factor2,Runx2)蛋白和mRNA表達(dá)的變化。采用多種靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-X的靶基因。PCR擴(kuò)增含靶位點(diǎn)的靶基因編碼區(qū)(coding sequence,CDS),產(chǎn)物連接pGL3載體,構(gòu)建野生型Hoxa2CDS熒光素酶報(bào)告基因載體,采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變型Hoxa2CDS熒光素酶報(bào)告基因載體,分別與miR-X表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染BMP-2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞,通過(guò)熒光素酶活性變化證實(shí)Hoxa2是否為miR-X靶基因。

7、將miR-X表達(dá)載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞,采用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Hoxa2蛋白和mRNA水平的變化,驗(yàn)證miR-X對(duì)Hoxa2的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:(1)miR-X過(guò)表達(dá)促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的ALP活性增高和OC分泌,并增加Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)。(2)抑制miR-X的作用降低了ST2成骨分化過(guò)程中的ALP活性及OC分泌的上升程度,并部分抑制Runx2 mRNA和蛋白

8、的表達(dá)。(3)Rnas22預(yù)測(cè)Hoxa2為miR-X的靶基因。(4)與對(duì)照組相比,共轉(zhuǎn)染野生型Hoxa2 CDS熒光素酶報(bào)告基因載體及miR-X表達(dá)載體的ST2細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降,而共轉(zhuǎn)染突變型Hoxa2 CDS熒光素酶報(bào)告基因載體及miR-X表達(dá)載體的ST2細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化。(5)轉(zhuǎn)染miR-X表達(dá)載體的ST2細(xì)胞Hoxa2蛋白水平下降,但Hoxa2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論:miR-X在轉(zhuǎn)錄后水平

9、抑制靶基因Hoxa2,增加轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá),從而促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞的成骨分化。
　　 第三部分miR-X和miR-2861與轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互調(diào)控的功能研究
　　 目的:探索兩個(gè)新克隆的miRNA,miR-X和miR-2861之間的關(guān)系及其與轉(zhuǎn)錄因子Runx2的相互作用。
　　 方法:通過(guò)BLAST等生物信息學(xué)方法尋找miR-X與miR-2861在基因組上的定位,分析兩者之間的位置關(guān)系,采

10、用Mfold軟件預(yù)測(cè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(primary microRNA,pri-miRNA)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)國(guó)外公布的人類(lèi)及小鼠轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)預(yù)測(cè)文庫(kù),根據(jù)第四位賴(lài)氨酸三甲基化的H3組蛋白(H3K4me3)在TSS位點(diǎn)周?chē)母患c啟動(dòng)子CpG島為主要標(biāo)識(shí),預(yù)測(cè)miR-X/miR-2861表達(dá)簇的TSS。運(yùn)用TF-seach轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析miR-X/miR-2861表達(dá)簇的TSS上游2kb內(nèi)的DNA序列,預(yù)測(cè)可能的Runx

11、2結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)染色體免疫沉淀法(ChIP),采用Runx2抗體(anti-Runx2)驗(yàn)證Runx2與所預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的相互關(guān)系。通過(guò)PCR擴(kuò)增Ⅱ型Runx2 cDNA并亞克隆至pSG5載體,構(gòu)建Runx2表達(dá)載體pSG5-Runx2,轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞,并將體外合成的特異性阻斷Runx2蛋白表達(dá)的小干擾RNAsiRNA-Runx2,轉(zhuǎn)染BMP-2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞,分別采用Northern blot檢測(cè)miR-X和miR-2861的表達(dá),研

12、究Runx2對(duì)miR-X與miR-2861表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:(1)miR-X與miR-2861在小鼠第2染色體上的基因定位僅相差69bp,兩者以miR-X/miR-2861表達(dá)簇的形式存在。(2)確定miR-X/miR-2861表達(dá)簇的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于小鼠第2染色體10,104,622。(3)預(yù)測(cè)Runx2在miR-X/miR-2861表達(dá)簇啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)在其TSS上游2kb。(4)ChIP證實(shí)Runx2結(jié)合于

13、所預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。(5)與對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染Runx2表達(dá)載體的ST2細(xì)胞中,miR-X與miR-2861的表達(dá)增強(qiáng)。而轉(zhuǎn)染siRNA-Runx2的BMP-2誘導(dǎo)ST2細(xì)胞miR-X與miR-2861的表達(dá)降低。
　　 結(jié)論:miR-X與miR-2861在基因組中成簇存在,共同轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子Runx2通過(guò)與miR-X/miR-2861表達(dá)簇的啟動(dòng)子結(jié)合,促進(jìn)表達(dá)簇的轉(zhuǎn)錄,并與miR-X和miR-2861形成正反饋調(diào)控環(huán)