轉(zhuǎn)錄因子Satb2和Runx2在牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控功能及其在骨與牙周創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的作用研究.pdf

1、本研究在體外分離培養(yǎng)并鑒定牙囊細(xì)胞分化潛能的基礎(chǔ)上，研究了Satb2在牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，并通過(guò)體內(nèi)牙周創(chuàng)傷模型明確了牙囊細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及Satb2和Runx2在牙周組織修復(fù)過(guò)程中的作用，以期為牙周組織工程學(xué)篩選促進(jìn)牙周再生的種子細(xì)胞和調(diào)控因子提供新的理論依據(jù)。 材料和方法： 第一部分：本實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)基因小鼠mBSP9.0Luc/BACT-EGFP攜帶的外源性基因是小鼠BSP上游9.0 kb啟動(dòng)子序

2、列調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)啟動(dòng)子及巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子(cylomegalovims enhancer)調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)。從已鑒定的5-7天齡的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分離牙囊細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。在體外以10-8mol/l地塞米松、10mmol/1β-甘油磷酸鈉、50mg/l維生素C)誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)

3、胞的分化，以茜素紅染色法檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)的形成；以10-8M地塞米松和6ng/ml胰島素誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，并用油紅O(Oil Red O)染色鑒定；以10-8mol/L地塞米松、10mmol/L維生素C和5μg/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，并以阿利新蘭染色鑒定。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)均以從6-8周大的mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠中分離的骨髓基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)照； 第二部分：本實(shí)驗(yàn)用原位雜交檢

4、測(cè)了小鼠胚胎14.5天時(shí)頜骨和牙胚中Satb2的表達(dá)；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將Satb2表達(dá)載體pcDNA3.1-Satb2轉(zhuǎn)入骨髓基質(zhì)細(xì)胞和牙囊細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)Satb2的過(guò)表達(dá)，并用半定量RT-PCR檢測(cè)骨特異性基因和成骨分化調(diào)控因子的表達(dá)；用逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBABE-hygro-Satb2)感染小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3，并用遷移速率實(shí)驗(yàn)(Scratch wound assay)檢測(cè)Satb2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移速率的影響；為檢測(cè)Satb2對(duì)Os

5、x基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，將含有Osx全長(zhǎng)啟動(dòng)子(-2020/+13)的報(bào)告載體與Satb2和/或Runx2表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞中，并檢測(cè)熒光素酶表達(dá)水平的變化；用逆轉(zhuǎn)錄病毒(pBABE-hygro-Satb2)感染mBSP9.0Luc/BACT-EGFP小鼠牙囊細(xì)胞(DFCs)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)，并將這些細(xì)胞植入B6D2F1小鼠的牙周創(chuàng)傷模型中，用H&E染色、免疫組化染色和組織學(xué)測(cè)量評(píng)價(jià)Sa

6、tb2過(guò)表達(dá)對(duì)牙周創(chuàng)傷愈合的作用。 第三部分：本實(shí)驗(yàn)用H&E染色和組織學(xué)測(cè)量評(píng)價(jià)了6-8周的Runx2+/-小鼠和Runx2+/+小鼠的牙周創(chuàng)傷和股骨創(chuàng)傷的愈合情況；用基因激活基質(zhì)(gene-activated matrix，GAM)將Runx2表達(dá)載體pCMV-Osf2/Cbfa1引入7周大的Runx2+/+(野生小鼠)的牙周創(chuàng)區(qū)，并用H&E染色，免疫組化染色，組織學(xué)測(cè)量和半定量RT-PCR評(píng)價(jià)Runx2過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠牙周創(chuàng)傷愈

7、合的作用。 結(jié)果： 第一部分：體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代后，細(xì)胞密度增高，細(xì)胞的大小和形態(tài)接近一致。牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)骨相誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4周并經(jīng)茜素紅染色后可見(jiàn)致密紅染的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)形態(tài)并無(wú)明顯差別，但牙囊細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較少，牙囊細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的茜素紅沉積量也顯著低于骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。經(jīng)脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)后，牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生明顯變化。油紅O(Oil

8、 Red O)染色后兩組細(xì)胞均可見(jiàn)到陽(yáng)性染色的脂肪滴形成，但是牙囊細(xì)胞培養(yǎng)物中的脂肪滴形成少于骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，提示前者的成脂肪細(xì)胞能力弱于后者。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，牙囊細(xì)胞中脂蛋白酯酶(LPL)的表達(dá)量顯著低于骨髓基質(zhì)細(xì)胞中LPL的表達(dá)量。經(jīng)軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)和阿利新蘭染色(Alcian blue)后牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)均可見(jiàn)類軟骨樣嗜阿利新蘭染色的基質(zhì)，但牙囊細(xì)胞中阿利新蘭染色的強(qiáng)度弱于骨髓基質(zhì)細(xì)胞。用半定量RT-

9、PCR檢測(cè)小鼠α1(Ⅱ)procollagen表達(dá)水平的結(jié)果顯示，牙囊細(xì)胞中α1(Ⅱ)procollagen的表達(dá)水平顯著低于骨髓基質(zhì)細(xì)胞。第二部分：Satb2在切牙牙胚的間充質(zhì)成分中高水平表達(dá)，但在上皮成分中不表達(dá)。同時(shí)，Satb2在發(fā)育中的顎骨和下頜骨基質(zhì)中也高水平表達(dá)，但在Meckel’s軟骨中不表達(dá)。在發(fā)育中的正在向中線生長(zhǎng)的腭突邊緣，Satb2的表達(dá)尤其強(qiáng)烈。過(guò)表達(dá)Satb2的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，BSP，Runx2，Osx和VEG

10、FA的表達(dá)均增強(qiáng)。BMP4可以誘導(dǎo)Satb2的表達(dá)，而且BMP4誘導(dǎo)的骨特異性基因和VEGF的表達(dá)模式與Satb2誘導(dǎo)的表達(dá)模式不同。Satb2在處于牙根發(fā)育階段的正常小鼠磨牙牙囊細(xì)胞中也有表達(dá)，而且Satb2在牙囊細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)也增強(qiáng)了BSP和Runx2的表達(dá)。過(guò)表達(dá)Satb2的MC3T3細(xì)胞中BSP，Osx，Runx2和VEGF的表達(dá)均增強(qiáng)。同時(shí)，Satb2過(guò)表達(dá)MC3T3細(xì)胞的遷移速率被輕度提高。Satb2在HEK-293細(xì)胞和M

11、C3T3-E1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)分別將Osx的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)了1.6和1.8倍，而Runx2在HEK-293細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)將Osx啟動(dòng)子活性分別增強(qiáng)了1.8和2.52倍。另外，Satb2可將Runx2的激活效應(yīng)增強(qiáng)2倍。H&E染色，免疫組化染色和組織學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示Satb2在牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化和牙周手術(shù)創(chuàng)傷的愈合。 第三部分：H&E染色，免疫組化染色和組織學(xué)測(cè)量結(jié)果表明Runx2基因單

12、倍劑量不足導(dǎo)致小鼠牙周及股骨創(chuàng)區(qū)愈合不良，而在野生小鼠牙周創(chuàng)區(qū)局部釋放Runx2質(zhì)粒促進(jìn)了牙周創(chuàng)區(qū)的愈合。組織學(xué)測(cè)量表明術(shù)后7天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度比較非創(chuàng)傷側(cè)均有輕度增寬，但術(shù)后14天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度降低，與非創(chuàng)傷側(cè)的牙周膜寬度相比，差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR和免疫組化染色結(jié)果也顯示在牙周創(chuàng)區(qū)內(nèi)應(yīng)用GAM技術(shù)導(dǎo)入Runx2表達(dá)載體可在術(shù)后7天顯著增強(qiáng)Runx2在牙周創(chuàng)區(qū)內(nèi)的表達(dá)，而在術(shù)后14天仍能維持一個(gè)較高

13、水平的Runx2表達(dá)，同時(shí)BSP的表達(dá)也得到增強(qiáng)。 結(jié)論： 在本研究中，我們用體外誘導(dǎo)的方法成功誘導(dǎo)了牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的分化，進(jìn)一步證實(shí)了牙囊細(xì)胞中具有多向分化潛能的干細(xì)胞的存在。研究表明，雖然牙囊細(xì)胞可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，但牙囊細(xì)胞培養(yǎng)物的特殊染色強(qiáng)度均低于骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，提示牙囊細(xì)胞的多向分化潛力弱于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，或同樣的細(xì)胞總數(shù)內(nèi)牙囊細(xì)胞中干細(xì)胞的比例小于骨髓

14、基質(zhì)細(xì)胞中干細(xì)胞的比例。Satb2在顎骨和頜骨基質(zhì)中的高水平表達(dá)證實(shí)了Satb2在成骨細(xì)胞分化和骨形成過(guò)程中的重要作用，而satb2在腭突邊緣的高水平表達(dá)也與病案報(bào)道和動(dòng)物研究中Satb2與腭裂相關(guān)的結(jié)論相一致。Satb2牙胚中的表達(dá)模式提示Satb2在牙齒間充質(zhì)組分如牙本質(zhì)，牙髓和牙周組織的發(fā)育過(guò)程中也起一定的作用。Satb2在骨髓基質(zhì)細(xì)胞、牙囊細(xì)胞以及小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3中過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了骨基質(zhì)蛋白BSP的表達(dá)水平，同時(shí)也增強(qiáng)了促進(jìn)

15、成骨的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和osterix的表達(dá)水平。而且，Satb2不僅可以直接促進(jìn)osterix的表達(dá)，而且還可以通過(guò)與Runx2的協(xié)同作用增強(qiáng)Runx2促進(jìn)osterix表達(dá)的作用。Satb2還增強(qiáng)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFA的表達(dá)水平，提示Satb2在組織修復(fù)過(guò)程中可能還具有促進(jìn)血管生成的能力。細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果提示創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，Satb2可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向創(chuàng)區(qū)遷移而不斷補(bǔ)充衰老和凋亡的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，從而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)

16、傷愈合的目的。另外，Satb2基因功能缺陷導(dǎo)致的腭裂也可能與Satb2促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力受到影響有關(guān)。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和牙周創(chuàng)傷模型，我們證實(shí)了Satb2在種子細(xì)胞(牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞)中過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了牙周創(chuàng)傷的愈合速度，并增強(qiáng)了干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力。然而，植入牙囊細(xì)胞和植入骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)牙周創(chuàng)傷愈合的促進(jìn)能力并沒(méi)有明顯的差別。Runx2+/-小鼠中由于Runx2基因的單倍劑量不足造成骨創(chuàng)傷的愈合的延緩，提示Runx2在骨及牙周創(chuàng)