克羅恩病β-防御素-2基因多態(tài)性及其轉(zhuǎn)錄活性的研究.pdf

1、研究背景和目的： 克羅恩病是炎癥性腸病的一個主要類型，表現(xiàn)為胃腸道的慢性、反復(fù)發(fā)作性和非特異性的全腸壁炎，病變呈節(jié)段性分布，可發(fā)生于胃腸道的任何部位，但好發(fā)于回腸、結(jié)腸(包括回盲部)和肛周。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的右下腹痛和臍周痛，可伴有腹瀉、腹部炎性腫塊、肛門病變及其它系統(tǒng)性癥狀。 腸道是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在接觸大量的食物和消除病原微生物的過程中，腸黏膜屏障起了重大的作用。由生理性屏障結(jié)構(gòu)和天然存在的抗微生物分子

2、構(gòu)成的先天性免疫，是宿主腸道防御系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明，哺乳動物小腸潘氏細胞分泌的防御素，是腸道天然免疫的重要組成部分。近年來，防御素家族在先天性防御體系中的作用日益受到關(guān)注。國外學者發(fā)現(xiàn)克羅恩病可能是一種防御素缺陷綜合癥，主要表現(xiàn)為hBD-2、hBD-3[1，2,3]的缺乏；hBD-2啟動子區(qū)基因改變亦可導(dǎo)致機體表達低拷貝數(shù)的hBD-2[4，5]。我們課題組在前期工作中通過免疫組化和原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者腸粘膜確實存在著h

3、BD-2表達量的減少。我們對hBD-2啟動子區(qū)基因測序分析發(fā)現(xiàn)了CD患者在-233位點有多態(tài)性改變，這個改變位點相鄰于核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B的結(jié)合位點，因而考慮是否上述改變影響了NF-KB與hBD-2啟動子區(qū)的結(jié)合，降低hBD-2轉(zhuǎn)錄活性和表達[5]。本研究擬在此基礎(chǔ)上檢測該多態(tài)位點并進行基因分型，同時構(gòu)建hBD-2雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒用于防御素在CD中的功能學研究。 Ogura等[6]發(fā)現(xiàn)CARCD15/NOD2的三個基因

4、多態(tài)性位點R702W、G908R與3020insC與西方白種人CD呈顯著性相關(guān)。NOD2蛋白能通過自身的模式識別受體識別微生物的多種分子結(jié)構(gòu)模式如細菌脂多糖和胞壁酰二肽從而激活NF-KB，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，炎癥因子再正向反饋激活NF-KB，如此擴大炎癥反應(yīng)。NOD2基因的突變是CD的危險因素，會導(dǎo)致約3％的NOD2蛋白中LRR缺失或截短，這些變異會影響其功能，使得NOD2蛋白無法激活NF-KB，從而抑制先天性防御反應(yīng)。因此許多學者認為

5、NOD2蛋白是腸道細菌免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。本課題組在中國人中未發(fā)現(xiàn)上述3個常見的SNP，但發(fā)現(xiàn)可能與中國人CD相關(guān)的CARD15/NOD2多態(tài)性位點P268S改變，其基因第802位堿基由C變成T，密碼子由CCC變成UCC，編碼氨基酸由脯氨酸變成絲氨酸，發(fā)生率為10.4％，而在UC及正常人中均無陽性發(fā)現(xiàn)；另外，該多態(tài)性與臨床特征有一定相關(guān)性，因此，NOD2/CARD15基因的P268S改變可能是中國人CD的SNp。目前本課題組已經(jīng)成功構(gòu)建

6、了野生型和P268S突變型NOD2基因真核表達載體，本研究將構(gòu)建人β-防御素-2雙熒光素酶報告基因載體及其克羅恩病相關(guān)突變體，與NOD2真核表達載體共轉(zhuǎn)染以研究CD的基因多態(tài)性改變對先天性免疫的影響。 LPS是革蘭氏陰性細菌的主要表面成分，是動物免疫系統(tǒng)對入侵的革蘭氏陰性菌的首要識別及攻擊目標，同時也在細菌在黏附、入侵和逃避免疫攻擊中起著重要的作用。腫瘤壞死因子-a是機體在感染、休克、創(chuàng)傷中引起細胞、組織損傷的最重要的炎性介質(zhì)之

7、一，腸道內(nèi)大量的細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素可刺激TNF-a的合成和釋放。研究證實在IBD患者糞便中TNF-a的濃度與結(jié)腸炎癥的嚴重程度相關(guān)。 本研究目的是進一步開展hBD-2啟動子區(qū)域態(tài)性檢測，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究NOD2基因P268S改變及hBD-2啟動子區(qū)域多態(tài)性突變對先天性防御活性物質(zhì)即hBD-2的影響。 材料和方法： 1、選取南方醫(yī)院消化科及普外科2004年01月到2007年10月經(jīng)內(nèi)鏡檢查和(或)手術(shù)

8、及病理確診的CD患者30例，門診健康體檢者30例，空腹抽取靜脈血5ml；提取靜脈血基因組DNA后，聚合酶鏈反應(yīng)擴增目的片段。將PCR產(chǎn)物純化后采用直接測序，通過與基因數(shù)據(jù)庫對照并分析測序圖，并對基因型和等位基因進行統(tǒng)計學分析。 2、利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建包含hBD-2基因啟動子活性區(qū)域的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒hBD-2-780-luc；利用定點突變技術(shù)在hBD-2啟動子序列-233位點引入堿基突變，構(gòu)建克羅恩病相關(guān)突變體hBD-2

9、-mut-luc。 3、質(zhì)粒hBD-2-780-luc和pcDNA-wild-NOD2-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，使用不同濃度的LPS和TNF-a來刺激HEK293T細胞，通過檢測熒光素酶活性來選擇最佳濃度，取該濃度用于研究NOD2基因多態(tài)性改變及hBD-2啟動子區(qū)多態(tài)性改變對hBD-2轉(zhuǎn)錄活性的影響。 4、hBD-2報告基因質(zhì)粒和NOD2真核表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，在LPS和TNF-a分別刺激細胞24h后

10、，通過Western-blot及RT-PCR法檢測NOD2蛋白表達水平和轉(zhuǎn)錄水平；用GloMaxTM20/20Luminometer測定雙熒光素酶的表達來研究hBD-2轉(zhuǎn)錄活性變化。 5、質(zhì)粒hBD-2-780-luc和pcDNA-wild-NOD2-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，24h后同時加入TNF-a和BAY11-7082再培養(yǎng)24h，然后測定熒光素酶表達活性來研究hBD-2轉(zhuǎn)錄活性變化。 6、本文均采用SPSS1

11、3.0進行統(tǒng)計分析。第一章中的基因型和等位基因頻率作為計數(shù)資料用頻數(shù)表示，采用x2檢驗。第三章中濃度梯度實驗組間熒光素酶活性倍數(shù)分析使用單向方差分析；LPS處理組間采用析因設(shè)計資料的方差分析；TNF-a處理組間采用單向方差分析；當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、CD組和健康對照組的基因型數(shù)量在統(tǒng)計學上有顯著性差異，CD組的雜合子數(shù)量多于健康對照組(P=0.016)；CD組與健康對照組在基因頻率上有顯著性

12、差異，在CD中等位基因C的頻數(shù)高于健康組(P=0.039)。 2、經(jīng)克隆、酶切鑒定及基因測序證實成功構(gòu)建hBD-2啟動子熒光素酶報告基因載體hBD-2-780-luc及其克羅恩病相關(guān)突變體hBD-2-mut-luc。 3、各表達載體瞬時轉(zhuǎn)入HEK293T細胞48小時后，通過WesternBlot及RT-PCR在pcDNA-wild-NOD2-HA轉(zhuǎn)染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉(zhuǎn)染組中檢測到NOD2蛋白和m

13、RNA的表達，而pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組未檢測到NOD2蛋白的表達。 4、用不同濃度LPS刺激細胞24h后，HEK293T細胞hBD-2轉(zhuǎn)錄活性有劑量依賴性，劑量越高，hBD-2轉(zhuǎn)錄活性越低，當LPS濃度為1μg/μl時較無LPS刺激時顯著降低(P=0.020)。 5、在TNF-a刺激細胞24h后，HEK293T細胞hBD-2轉(zhuǎn)錄活性相對升高，并有劑量依賴性，濃度為5ng/ml時表達活性增強至無TNF-a刺激時的2.

14、5倍以上(P=0.002)，但當濃度達到10ng/ml時則對hBD-2轉(zhuǎn)錄活性無顯著影響(P=0.442)。 6、LPS存在時，pcDNA-wild-NOD2-HA轉(zhuǎn)染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉(zhuǎn)染組hBD-2轉(zhuǎn)錄活性有顯著性差異(P=0.008)；NOD2蛋白的P268S多態(tài)性改變和細菌壁成分LPS刺激對hBD-2的誘導(dǎo)作用無交互作用，相互獨立(P=0.152)；hBD-2-780-luc轉(zhuǎn)染組和hBD-2-m

15、ut-luc轉(zhuǎn)染組的hBD-2轉(zhuǎn)錄活性無顯著性差異(P=0.053)；hBD-2啟動子多態(tài)性改變和細菌壁成分LPS刺激對NOD2蛋白介導(dǎo)的防御素轉(zhuǎn)錄無交互作用，相互獨立(P=0.247)。 7、在TNF-a(5ng/ml)刺激時pcDNA-wild-NOD2-HA轉(zhuǎn)染組和pcDNA-NOD2-P268S-HA轉(zhuǎn)染組hBD-2轉(zhuǎn)錄活性無顯著性差異(P=0.064)；而在TNF-a(5ng/ml)刺激時，hBD-2-mut-luc轉(zhuǎn)

16、染組和hBD-2-780-luc轉(zhuǎn)染組的hBD-2轉(zhuǎn)錄活性有顯著性差異(P=0.006)。 8、在TNF-a(5ng/ml)刺激轉(zhuǎn)染有pcDNA-wild-NOD2-HA的細胞之前用NF-KB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理可明顯抑制hBD-2轉(zhuǎn)錄的活化(P=0.002)。 結(jié)論： 1、在部分中國人CD中經(jīng)過直接測序法發(fā)現(xiàn)CD相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點：hBD-2啟動子區(qū).233位點，堿基G→C。 2、成功構(gòu)

17、建了hBD.2啟動子熒光素酶報告載體hBD-12-780-luc及其克羅恩病相關(guān)突變體hBD-2-mut-luc，并在HEK293T細胞中活化，該載體可作為研究CD發(fā)病機制及藥物研發(fā)的工具。 3、過量的抗原刺激可能抑制先天性防御物質(zhì)的產(chǎn)生；適量的炎癥因子(TNF-a)激發(fā)先天性防御物質(zhì)的產(chǎn)生，過量的炎癥因子則抑制其產(chǎn)生。 4、NOD2蛋白的表達可以促進HEK293T細胞的先天性免疫反應(yīng)，介導(dǎo)先天性免疫；NOD2蛋白的P2