ATG16L1和IRGM基因多態(tài)性與克羅恩病相關(guān)性的初步研究.pdf

1、背景及目的： 克羅恩病(Crohn’sdisease，CD)是炎癥性腸病(IBD)的一個(gè)主要類型，是一種累及全層的節(jié)段性腸道非特異性炎癥。CD在歐美國(guó)家常見，發(fā)病率約為1‰～10‰左右，亞洲的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國(guó)家。近年來隨著臨床醫(yī)生對(duì)CD認(rèn)識(shí)的不斷深入，以及臨床內(nèi)鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其雙氣囊小腸鏡的應(yīng)用，中國(guó)CD的檢出率也有逐年上升的趨勢(shì)。目前CD的病因及發(fā)病機(jī)制并不明確，臨床表現(xiàn)也復(fù)雜多樣，且容易誤診，復(fù)發(fā)率高，目前并無根治方

2、法，臨床常用藥物治療及手術(shù)效果往往欠佳，復(fù)發(fā)率高，無法徹底解決患者痛苦，嚴(yán)重危害人類的健康。 人類的健康狀態(tài)離不開體內(nèi)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，而細(xì)胞穩(wěn)態(tài)依賴于大分子物質(zhì)生物合成和分解代謝之間的平衡。自噬(autophagy)是細(xì)胞用來達(dá)到這種動(dòng)態(tài)平衡的重要機(jī)制之一，它普遍存在于大部分真核細(xì)胞中，從酵母到人類存在著共同的自噬分子調(diào)控機(jī)制。真核細(xì)胞的降解主要有兩種途徑，即蛋白酶降解和自噬，但只有自噬具有降解整個(gè)細(xì)胞器的效力。自噬是大分子物質(zhì)和

3、細(xì)胞器在溶酶體腔發(fā)生的降解途徑，其作用主要是清除降解細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器、以及不再需要的生物大分子等，同時(shí)也為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的構(gòu)建提供原料，即細(xì)胞結(jié)構(gòu)的再循環(huán)。因此，自噬是細(xì)胞成分更新、發(fā)育、分化及組織重塑的重要調(diào)控機(jī)制。自噬現(xiàn)象的存在對(duì)于防止如神經(jīng)退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及對(duì)防止老化、延長(zhǎng)壽命都有積極作用。因此對(duì)細(xì)胞自噬作用和自噬型細(xì)胞死亡的研究具有非常重要的價(jià)值。自噬基因的發(fā)現(xiàn)使我們從分子水

4、平認(rèn)識(shí)了自噬，自噬與病原微生物侵染之間的關(guān)系體現(xiàn)在吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞可殺死細(xì)胞外的病原菌，當(dāng)病原菌以內(nèi)吞形式進(jìn)入細(xì)胞后自噬是細(xì)胞主要的防御形式。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)自噬的消長(zhǎng)受多種因素影響：營(yíng)養(yǎng)缺乏、胰高血糖素可以誘導(dǎo)自噬；胰島素抑制自噬。他們的作用點(diǎn)在于影響氨基酸的濃度，當(dāng)氨基酸濃度降低時(shí)，自噬啟動(dòng)以產(chǎn)生氨基酸保證器官成活；相反自噬被抑制。當(dāng)自噬過程被干擾，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器、不再需要的生物大分子、進(jìn)入胞內(nèi)的細(xì)菌等不能及

5、時(shí)被清除，這些未能及時(shí)被清除的受損細(xì)胞、無用的蛋白質(zhì)、細(xì)菌等會(huì)觸發(fā)不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，導(dǎo)致腸壁慢性炎癥及CD特征性的消化道改變。 此外，CD免疫調(diào)節(jié)異常學(xué)說認(rèn)為，感染、病毒及藥物等可破壞腸上皮屏障，使腸黏膜通透性增加、腸上皮細(xì)胞腫脹、吸收功能降低，上皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏、腸上皮細(xì)胞腫脹也有同胰島素一樣的抑制自噬的作用(如在肝組織，細(xì)胞容積的增大促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)的合成；抑制自噬性蛋白降解)，其機(jī)理一是細(xì)胞內(nèi)的氨基酸濃度增高；二是細(xì)胞

6、內(nèi)的離子濃度改變Ⅲ。此外，腸腔內(nèi)攝入大量抗原，腸組織暴露于大量的抗原中，可誘發(fā)遺傳易感宿主的黏膜反應(yīng)，反復(fù)的刺激使腸道免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)和錯(cuò)誤識(shí)別，激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，釋放一系列的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。免疫過程一旦被啟動(dòng)，免疫炎癥反應(yīng)就會(huì)逐級(jí)放大，最終導(dǎo)致組織損傷，出現(xiàn)CD的臨床表現(xiàn)和病理改變[2]。 目前，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證明CD是一種復(fù)雜的多基因疾病，基因易感性和腸道細(xì)菌性抗原的相互影響和

7、相互作用成為CD發(fā)生的重要因素，這一觀點(diǎn)已逐漸被人們所認(rèn)可，即攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下，免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。隨著基因研究的不斷發(fā)展，最早明確的與歐美人CD易感性相關(guān)的NOD2／CARD15基因的單核苷酸多態(tài)性性(singlenucleotidePolymorphisms，SNP)位點(diǎn)與中國(guó)人CD易感性并無明顯相關(guān)；國(guó)外研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)與機(jī)體自噬作用相關(guān)的ATG16L1基因及IRGM基因序列SNP位點(diǎn)與CD明顯相關(guān)，

8、發(fā)現(xiàn)并證實(shí)ATG16L1基因上有一個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2241880)，IRGM基因上有2個(gè)SNP位點(diǎn)(rs13361189、rs4958847)與歐美白種人CD易感性有顯著相關(guān)。 本研究在國(guó)內(nèi)外既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)目前國(guó)外新研究發(fā)現(xiàn)的與歐美白種人CD易感性相關(guān)的自噬體基因ATG16L1與IRGM基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了研究，我們選取了國(guó)外研究報(bào)道中與歐美CD易感性相關(guān)的兩個(gè)基因共3個(gè)SNP位點(diǎn)，初步研究與歐美人CD相關(guān)的易感性

9、基因SNP位點(diǎn)與中國(guó)人CD易感性的關(guān)系，以及該SNP與CD臨床特征的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究CD發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為防治該病提供理論依據(jù)。 方法： 1、收集2004-2007年南方醫(yī)院消化科及普外科確診臨床資料完整、彼此無血源關(guān)系的廣東及外省籍CD、UC患者(診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制定標(biāo)準(zhǔn)[27]，所有患者均除外合并其它自身免疫性疾病)各40例；UC患者中病變部位位于直腸6例，左半結(jié)腸11例，右半結(jié)腸4

10、例，全結(jié)腸19例，其中男27例，女13例，平均年齡36.38±12.00；CD患者中病變部位位于小腸15例，結(jié)腸13例，小腸合并結(jié)腸8例，直腸4例；CD按疾病的活動(dòng)度分，緩解期6例，活動(dòng)期34例，其中男26例，女14例，平均年齡32.7±9.46。對(duì)照組取門診健康體檢者50例，其中男32例，女18例，平均年齡34.58±9.37歲。所有研究對(duì)象均抽取外周血。提取白細(xì)胞基因組DNA，根據(jù)ATG16L1、IRGM基因三個(gè)SNP位點(diǎn)所在的外顯

11、子設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增目的片段。 2、成功擴(kuò)增40例CD患者ATG16L1基因第九外顯子后，將PCR產(chǎn)物純化，然后通過美國(guó)SIB3730XL測(cè)序儀全自動(dòng)測(cè)讀序列，并與基因庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)改變后，對(duì)該樣本序列進(jìn)行反向測(cè)序，明確該SNP位點(diǎn)多態(tài)性改變，并用同樣的一對(duì)引物擴(kuò)增40例潰瘍性結(jié)腸炎患者和50例健康體檢者ATG16L1基因相應(yīng)目的片斷，純化PCR產(chǎn)物，用同樣的方法測(cè)序并與基因庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)照。 3、成功擴(kuò)增

12、IRGM基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)所在的基因片斷后，根據(jù)兩個(gè)目的基因的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)酶切引物及選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增目的基因片段，成功擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，選擇TasI(TspEI)和AluI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定由國(guó)外研究證實(shí)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs13361189和rs4958847；并發(fā)現(xiàn)其在UC組及健康體檢組的發(fā)生頻率。 結(jié)果： 1、ATG16L1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2241880與中國(guó)部分CD的相關(guān)性

13、 通過DNA測(cè)序及對(duì)SNP位點(diǎn)發(fā)生雜合子改變和純合子改變的樣本進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證，多態(tài)性位點(diǎn)rs2241880，其堿基由A變?yōu)镚，密碼子由ACT變?yōu)镚CT，編碼的氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)楸彼?。病例組和正常對(duì)照組進(jìn)行基因型頻率及等位基因頻率的組間比較顯示：CD患者該SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率與正常人群比較基因型頻率及等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其結(jié)果分別為x2=0.187，P=0.911；x2=0.227，P=0.893；同樣uc

14、患者該SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率與正常人群比較基因型頻率及等位基因頻率的結(jié)果分別為：x2=0.394，P=0.821；x2=0.220，P=0.639;P>0.05差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD與UC組基因型頻率及等位基因頻率相比結(jié)果分別為：x2=0.319，P=0.853；x2=0.102，P=0.750，提示CD與UC間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示ATG16L1基因中該多態(tài)性位點(diǎn)rs2241880與中國(guó)人IBD疾病易感性無顯著相關(guān)。

15、 2、IRGM基因多態(tài)性位點(diǎn)rs13361189、rs4958847與中國(guó)部分CD的相關(guān)性 PCR-RFLP法驗(yàn)證IRGM基因SNP位點(diǎn)rs13361189的40例CD患者中，SNP位點(diǎn)發(fā)生改變的有36例，其中12例為純合子，24例為雜合子；40例UC患者中24例發(fā)生多態(tài)性改變，其中10例為純和子，14例為雜合子；50例健康者中46例發(fā)生多態(tài)性改變，其中18例為純和子，28例為雜合子。各組間基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x

16、2=1.669，P=0.796)；等位基因頻率比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.416，P=0.812)。通過PCR-RFLP法及基因測(cè)序相結(jié)合的方法驗(yàn)證IRGM基因多態(tài)性位點(diǎn)rs4958847，發(fā)現(xiàn)在40例CD患者中24例(40.0％)出現(xiàn)等位基因多態(tài)性的改變，經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)均為雜合子改變，其中男性15例(62.5％)，女性9例(37.5％)；在健康組28例發(fā)生等位基因改變(56.0％)，其中男性18例(64.3％)，女性10例(35

17、.7％)。經(jīng)比較顯示CD組與HC組間基因型頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.146，P=0.703)；等位基因頻率的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.087，P=0.769)。 結(jié)論： 1、我們研究發(fā)現(xiàn)國(guó)外報(bào)道的與歐美白種人CD易感性相關(guān)的ATG16L1的多態(tài)性位點(diǎn)rs2241880在中國(guó)人CD、UC和正常健康對(duì)照組之間并無顯著性差異，考慮ATG16L1基因中與歐美白種人CD易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)rs2241880，與我國(guó)C