老瓜頭生物總堿體外抗氧化抗炎作用研究.pdf

1、目的：氧化自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有強(qiáng)氧化性，能夠損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，引起慢性疾病，自由基能產(chǎn)生在人體的任何部位，許多炎癥相關(guān)疾病的產(chǎn)生都與體內(nèi)過多的自由基有關(guān)?；ㄉ南┧嵬窞榻?jīng)典的炎癥通路，cPLA2、COX-2是花生四烯酸反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，催化產(chǎn)生PGE2等炎癥因子的產(chǎn)生。氧化自由基及許多炎癥因子能夠激活花生四烯酸通路，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，許多抗炎藥物通過減少氧化自由基的產(chǎn)生，調(diào)控cPLA2-COX2-PGE2分子表達(dá)達(dá)

2、到抗炎作用。老瓜頭（Cynanchum komarovii Al.Iijinski，CK）又名牛心樸子，主要分布在寧夏等荒漠草原上，資源豐富。上世紀(jì)90年代從老瓜頭全草中提取了老瓜頭生物總堿（Total Alkaloid of Cynanchum Komarovii AI.Icjinski，TACKI），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明TACKI對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠、氣囊滑膜炎大鼠有抗炎作用，本實(shí)驗(yàn)主要從體外說明TACKI抗氧化作用，并能夠通過調(diào)控cPLA2

3、-COX2-PGE2分子水平達(dá)到抗炎作用。
　　第一部分:老瓜頭生物總堿體外抗氧化作用的研究
　　目的:通過體外化學(xué)方法研究TACKI的抗氧化作用。
　　方法：將老瓜頭生物總堿和維生素C分為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg·mL-1藥物濃度組。還原性藥物能將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，在700nm波長處有最大吸光度以此反映藥物的還原力，利用硫酸亞鐵與過氧化氫反應(yīng)生成羥自由基，測(cè)510nm藥物對(duì)羥自由基的清除

4、率，對(duì)過氧化氫引起紅細(xì)胞膜損傷的保護(hù)作用，測(cè)在415nm下的吸光度值，用硫代巴比妥酸法測(cè)藥物對(duì)肝脂質(zhì)過氧化物MDA的清除能力，在532nm處有最大吸收。通過體外測(cè)定還原力，羥自由基的清除率，對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用，對(duì)肝脂質(zhì)過氧化物MDA的清除能力研究TACKI的體外抗氧化作用。
　　結(jié)果：TACKI0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg·mL-1濃度組與相應(yīng)濃度維生素C相比，還原力均較弱（P<0.01）；在0.4、0.8、1.6

5、、3.2mg·mL-1濃度組TACKI與維生素C相比，對(duì)羥自由基的清除能力強(qiáng)（P<0.01）；TACKI濃度為0.2、0.4mg·mL-1時(shí)對(duì)紅細(xì)胞膜的抑制作用與維生素C相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；質(zhì)量濃度為0.8、1.6mg·mL-1TACKI對(duì)小鼠肝勻漿自發(fā)氧化生成MDA有抑制作用，其效應(yīng)強(qiáng)于相應(yīng)濃度維生素C（P<0.01）。
　　結(jié)論：TACKI還原力較相應(yīng)濃度維生素C弱但有較強(qiáng)的清除自由基的能力。
　　第二部分

6、:老瓜頭生物總堿對(duì)cPLA2-COX2-PGE2分子水平的影響
　　目的:通過確定TACKI作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞系的藥物濃度及對(duì)細(xì)胞活性的影響，研究TACKI對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在cPLA2-COX2-PGE2分子系統(tǒng)的調(diào)控作用。
　　方法：1、RAW264.7細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存及實(shí)驗(yàn)前處理。
　　2、采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為炎癥模型，以非甾體抗炎藥選擇性COX-2

7、酶抑制劑塞來昔布（Celecoxib）作為陽性對(duì)照。
　　3、通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法確定TACKI作用于RAW264.7的24h、48h、72h的量效曲線。
　　4、通過上述量效曲線確定TACKI孵育RAW264.7細(xì)胞的藥物濃度。利用MTT比色法確定此組藥物濃度及陽性對(duì)照對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。
　　5、LPS長時(shí)間刺激RAW264.7，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中前列腺素-E2

8、（PGE2）的含量，半定量RT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中COX-2mRNA的表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)COX-2的蛋白表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)cPLA2、COX-2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：TACKI藥物濃度為0.01μg·L-1,0.1μg·L-1,1μg·L-1無細(xì)胞毒性；與LPS組比較，TACKI(0.01μg·L-1,0.1μg·L-1,1μg·L-1)能降低PGE2的含量（P<0.05），TACKI（0

9、.01μg·L-1,0.1μg·L-1,1μg·L-1）可下調(diào)COX-2mRNA的表達(dá)（P<0.05），通過免疫熒光觀察，COX-2蛋白在細(xì)胞漿中表達(dá)，1μg·L-1TACKI能明顯減少COX-2蛋白的表達(dá)；通過Western blotting得出TACKI（0.01μg·L-1,0.1μg·L-1,1μg·L-1）的條帶明顯變細(xì)，與LPS組比較，TACKI能明顯減少COX-2及cPLA2的蛋白表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)論：T