微生物轉(zhuǎn)化虎杖中白藜蘆醇苷及其產(chǎn)物的分離純化.pdf

1、中藥虎杖是蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的根和莖，具有祛風(fēng)利濕，散瘀定痛，止咳化痰等功效。白藜蘆醇是虎杖中最有價(jià)值的成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等功效，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在食品添加劑、保健品、化妝品等行業(yè)。但是白藜蘆醇的含量偏低，加大了其生產(chǎn)成本。白藜蘆醇的糖苷化合物白藜蘆醇苷和白藜蘆醇具有相似的藥理作用，其含量遠(yuǎn)高于白藜蘆醇，但其生物利用度遠(yuǎn)低于白藜蘆醇。將糖苷轉(zhuǎn)化為其苷元通常由

2、酸水解或堿水解來實(shí)現(xiàn)。但是反應(yīng)需要高溫高壓等劇烈條件，不僅對(duì)設(shè)備要求高，而且對(duì)環(huán)境造成很大的污染。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法條件溫和，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，環(huán)境友好。本文利用生物轉(zhuǎn)化法直接將虎杖粗藥材中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，并對(duì)其分離純化工藝進(jìn)行了研究。 首先，篩選β-葡萄糖苷酶的高效產(chǎn)生菌食品級(jí)微生物米曲霉，對(duì)其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，并用此酶液對(duì)虎杖粗藥材中的白藜蘆醇苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，該β-葡萄糖苷酶的最適pH

3、值為4.8，最適溫度為50℃。用β-葡萄糖苷酶粗酶液對(duì)虎杖粗藥材中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化12小時(shí)，體系中白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)100％，白藜蘆醇的含量提高到原來的2.9倍。 在此基礎(chǔ)上，用米曲霉直接將虎杖粗藥材中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，并對(duì)其轉(zhuǎn)化機(jī)理進(jìn)行了研究。搖瓶發(fā)酵46小時(shí)使白藜蘆醇苷完全轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，白藜蘆醇的提取百分率提高到1.36％，是微波輔助提取的3.6倍。商品纖維素酶水解粗藥材12小時(shí)后達(dá)到了同樣高的提取百分率，但是

4、酶的昂貴價(jià)格限制了其工業(yè)應(yīng)用。酸水解粗藥材20分鐘可以將79.0％的白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇，但同時(shí)46.7％的白藜蘆醇在此過程中被破壞，因此酸水解不是一種可行的策略。相比較而言，微生物轉(zhuǎn)化法條件溫和，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)物收率高，具有很大的工業(yè)化潛力。 因此，在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上對(duì)菌種進(jìn)行馴化，并用5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵工藝的放大與優(yōu)化。結(jié)果表明，在溫度為37℃，通氣量為1.5vvm下發(fā)酵20小時(shí)后，將溫度升高到50℃繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，白藜蘆

5、醇苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)105％，白藜蘆醇的濃度提高到原來的3.4倍，達(dá)到了文獻(xiàn)報(bào)道的自然發(fā)酵72小時(shí)的水平。轉(zhuǎn)化機(jī)理研究表明，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷以游離狀態(tài)存在于藥材細(xì)胞中，發(fā)酵過程中白藜蘆醇苷被轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，同時(shí)藥材細(xì)胞壁上的纖維素被部分水解，從而有利于產(chǎn)物的提取。 其次，以乙醇/硫酸銨雙水相體系為溶劑，利用微波輔助雙水相提取分別從虎杖粗藥材和虎杖發(fā)酵液中提取了白藜蘆醇苷、白藜蘆醇和大黃素，并對(duì)其分相行為進(jìn)行了研究。選擇25％(w/

6、w)的乙醇和21％(w/w)的硫酸銨為提取劑從虎杖粗藥材中提取所得的白藜蘆醇苷和加熱回流與微波輔助提取的提取率相等，而白藜蘆醇和大黃素的提取率分別為微波輔助提取和加熱回流提取的1.1倍和1.9倍。選擇此雙水相體系對(duì)虎杖發(fā)酵液進(jìn)行提取，所得的白藜蘆醇和大黃素的提取率分別是微波輔助提取的1.2倍和3.3倍，分別是常溫?cái)嚢杼崛〉?.6倍和4.2倍。發(fā)酵液提取物中白藜蘆醇和大黃素的含量分別為微波輔助提取的1.3倍和2.3倍，分別為常溫?cái)嚢杼崛〉?/p>

7、1.4倍和2.6倍，而葡萄糖和多糖的含量分別為后兩者的27％和79％。微波輔助雙水相提取同時(shí)具備微波輔助提取和雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)，并把兩個(gè)操作步驟合為一步，提高了收率，降低了成本。因此，是一種很有前景的提取和分離目標(biāo)產(chǎn)物的方法。 最后，利用大孔樹脂結(jié)合聚酰胺柱層析從發(fā)酵液提取物中純化白藜蘆醇，并測(cè)定了大孔樹脂和聚酰胺對(duì)白藜蘆醇的吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，大孔樹脂和聚酰胺對(duì)白藜蘆醇的表觀靜態(tài)吸附量分別為11.70mg/g和57.90