短發(fā)夾狀RNA抑制COX-2表達(dá)對人肝癌細(xì)胞株黏附侵襲力的影響.pdf

1、第一部分短發(fā)夾狀RNA對人肝癌細(xì)胞株COX-2的抑制作用 目的：構(gòu)建針對人COX-2基因的短發(fā)夾狀RNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒，觀察shRNA對人肝癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響，為探討RNA干擾作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)合成針對COX-2的兩條shRNA模板序列，將其插入含有U6啟動(dòng)子的pGenesil-1載體中，得到shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒WBH1和WBH2，并設(shè)陰性對照質(zhì)粒HK。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2和

2、BEL7402，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。應(yīng)用RT-PCR法和Westernblot法分別檢測兩株細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的COX-2表達(dá)變化。 結(jié)果：經(jīng)酶切分析和測序證實(shí)COX-2shRNA真核表達(dá)載體已成功構(gòu)建。質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞和BEL7402細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率分別為60％，54％。質(zhì)粒WBH1導(dǎo)入細(xì)胞24h、48h、72h和96h后，RT-PCR法檢測COX-2mRNA表達(dá)抑制率，上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞

3、分別為18.5％，88.6％、52.8％和42.4％(P＜0.01)，BEL7402細(xì)胞分別為9％，45.1％、70.1％和56.3％(P＜0.01)。Westernblot法檢測蛋白抑制率，HepG2細(xì)胞分別為10.2％、80.5％、45.3％和39.0％(P＜0.01)。BEL7402細(xì)胞分別為8.3％、40.2％、66.4％和35.6％(P＜0.01)。HepG2細(xì)胞和BEL7402細(xì)胞分別以48h和72h抑制效果最強(qiáng)。質(zhì)粒WBH

4、2對COX-2的表達(dá)無影響(P＞0.05)。 結(jié)論：針對人COX-2的shRNA真核表達(dá)載體能明顯抑制不同肝癌細(xì)胞株的COX-2表達(dá)，其抑制效果與靶點(diǎn)的選擇有夫。 第二部分COX-2短發(fā)夾狀RNA對人肝癌細(xì)胞株HepG2黏附侵襲力的影響 目的：研究針對人COX-2的shRNA真核表達(dá)載體對肝癌細(xì)胞株HepG2黏附力和侵襲力的影響。 方法：以質(zhì)粒WBH1和陰性對照質(zhì)粒HK體外轉(zhuǎn)染48h后的HepG2細(xì)胞為檢

5、測細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照。MTT法觀察HepG2細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel黏附性的變化。Transwell小室實(shí)驗(yàn)以穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量評估HepG2細(xì)胞體外侵襲力的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染W(wǎng)BH1質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞與Matrigel的黏附率為(6.0±0.4)％，與空白對照組[(11.4±0.2)％]相比明顯下降(P＜0.01)，抑制率為47.4％。轉(zhuǎn)染W(wǎng)BH1質(zhì)粒的細(xì)胞穿膜數(shù)為(8.25±1.50)，與空白對照組