短發(fā)夾RNA抑制DACH1表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞Capan-1作用的研究.pdf

1、目的：本研究旨在探討細(xì)胞命運(yùn)決定因子（DACH1）在胰腺癌中的表達(dá)，構(gòu)建并篩選出對(duì) DACH1基因表達(dá)抑制效果最佳的干擾質(zhì)粒pshRNA-DACH1，進(jìn)一步研究敲減 DACH1表達(dá)對(duì)胰腺癌 Capan-1細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期及凋亡、遷移及侵襲能力的影響，為胰腺癌的基因診斷及分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用半定量RT-PCR、western blot法檢測DACH1基因在人4株胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1、BxPC-3、AsP

2、C-1、Capan-1）和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE6c7）中 mRNA及蛋白水平的表達(dá)差異。設(shè)計(jì)合成針對(duì)人DACH1基因的重組質(zhì)粒pshRNA-DACH1，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 Capan-1細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR和western blot法檢測并篩選出抑制效率最高的重組質(zhì)粒。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、cck8法檢測轉(zhuǎn)染前后DACH1表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，AnnexinⅤ-PE/

3、7ADD雙標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測對(duì)Capan-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，通過 TranswellTM侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)探討DACH1基因?qū)apan-1細(xì)胞侵襲遷移能力的作用。
　　結(jié)果：胰腺癌與正常組織細(xì)胞的基因表達(dá)顯示，Capan-1細(xì)胞中DACH1表達(dá)明顯升高；成功構(gòu)建干擾質(zhì)粒 pshRNA-DACH1，將其轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Capan-1后，篩選出對(duì)細(xì)胞DACH1表達(dá)干擾效果最佳的重組質(zhì)粒；克隆形成及cck8實(shí)驗(yàn)均提示干擾組細(xì)