短發(fā)夾狀RNA抑制livin基因在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中的表達(dá).pdf

1、目的：研究凋亡抑制因子Livin特異的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)在MCF7乳腺癌細(xì)胞中對外源livin基因表達(dá)的抑制作用。 方法：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建四組EGFP-Livin融合表達(dá)的重組質(zhì)粒：Pgenesil-8-livin-shRNA1，Pgenesil-8-livin-shRNA2，Pgenesil-8-livin-HK，Pgenesil-8-livin(Pgenesil-8為含有綠色熒光蛋白EGFP的空質(zhì)粒產(chǎn)品，shR

2、NAl，shRNA2為目的基因livin α的兩個(gè)干擾片斷，HK為通用陰性對照序列，livin表示GenBank中l(wèi)ivin α的cDNA序列中的CDS區(qū)，GI：15680240，)電轉(zhuǎn)染入MCF7乳腺癌細(xì)胞中，24h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，48h后用熒光顯微鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中EGFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后平均熒光強(qiáng)度，即標(biāo)志livin α在蛋白水平上的表達(dá)。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)

3、胞中l(wèi)ivin α在RNA水平的表達(dá)。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示載體成功轉(zhuǎn)染入MCF7乳腺癌細(xì)胞，四組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率40％-70％不等。轉(zhuǎn)染入Pgenesil-8-livin-shRNA1， Pgenesil-8-livin-shRNA2的兩組MCF7乳腺癌細(xì)胞中綠色熒光亮度都弱于轉(zhuǎn)染了 Pgenesil-8-livin-HK ，Pgenesil-8-livin 的兩組細(xì)胞中 EGFP 的亮度， Pgenesi

4、l-8-livin-shRNA2轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中目的基因mRNA的表達(dá)量與Pgenesil-8-livin轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量相比差異顯著(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Pgenesil-8-livin-shRNA1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中目的基因mRNA的表達(dá)量與Pgenesil-8-livin轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞相比無顯著差異(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：目的基因的干擾序列shRNA2對目的基因livin α在MCF7乳腺