短發(fā)夾RNA抑制缺氧誘導因子-1α表達對腦膠質瘤細胞增殖、侵襲及轉移的影響.pdf

1、目的：構建HIF-1α基因RNA干擾慢病毒載體，觀察沉默HIF-1α基因后對膠質母細胞瘤U87細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響。為進一步研究腦膠質瘤細胞增殖、侵襲及轉移機制以及基因治療提供理論基礎。
　　 方法：(1)選定HIF-1α基因RNAi靶序列，合成靶序列DNA，退火形成雙鏈DNA，與經XhoⅠ和HpaⅠ雙酶切后的慢病毒載體pLentilox3.7(pLL3.7)連接；產生的pLL3.7 HIF-1α慢病毒載體轉化大腸桿菌

2、DH5a，抽取質粒后，用限制性內切酶XbaⅠ和NotⅠ進行酶切鑒定，然后進行測序鑒定；(2)用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒載體共轉染包裝細胞293T細胞(磷酸鈣轉染法)，包裝產生慢病毒，將收集的病毒上清經高速離心濃縮后，按一定比例稀釋，然后感染293T細胞，用流式細胞儀檢測293T細胞GFP蛋白的表達水平，從而測定病毒滴度；(3)利用前期構建的HIF-1α基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默HIF-1α基因，構建HIF-1a-

3、shRNA的慢病毒表達載體，在脂質體介導下轉染人膠質母細胞瘤細胞U87；(4)采用RT-PCR和Western blot檢測HIF-1α基因干擾效率，MTT法檢測細胞生長增殖，遷移實驗檢測細胞的體外遷移能力，Transwell小室模型檢測細胞的體外侵襲及轉移能力。
　　 結果：(1)酶切和測序證實，構建出HIF-1a-shRNA的慢病毒載體pLL3.7 HIF-1a;(2)包裝慢病毒，測得離心的濃縮病毒懸液的滴度為2×108TU

4、/ml；(3)RT-PCR證實HIF-1α-shRNA的慢病毒載體干擾U87細胞，細胞HIF-1α的mRNA表達明顯下調；(4)Western blot檢測證實HIF-1a-shRNA的慢病毒載體干擾U87細胞，細胞HIF-1α的蛋白表達明顯下調；(5)MTT比色法、Transwell小室侵襲實驗顯示轉染重組質粒的實驗組與對照組相比，細胞增殖、侵襲能力受到明顯抑制差異顯著(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.體外成