人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ副磉_(dá)、純化以及對(duì)人胃癌細(xì)胞VEGF、COX-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?human macrophage metalloelastase，HME)是由活化的巨噬細(xì)胞分泌的一種MMPs，即MMP-12。HME可以分解纖溶酶原(plasminogen)，產(chǎn)生血管穩(wěn)定因子(angiostatin)，從而具有抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vaSCUlar endothelial growth factor.VEGF)被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子，在許多

2、腫瘤新生血管的形成中起最關(guān)鍵作用。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，COX-2蛋白過(guò)度表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，COX-2和VEGF在胃癌的進(jìn)展過(guò)程中可能存在協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出HME蛋白并進(jìn)行蛋白的純化、重折疊復(fù)性并在體外進(jìn)行干預(yù)胃癌細(xì)胞SGC7901，研究體外HME對(duì)人胃癌細(xì)胞VEGF、COX-2表達(dá)的影響。

3、 方法:對(duì)轉(zhuǎn)化原核表達(dá)載體pET-28a(+)-HMEcd的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)HME，并行SDS-PAGE及Western blot鑒定。His Band鎳柱親和層析純化，透析重折疊復(fù)性，濃縮后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，明膠酶譜分析實(shí)驗(yàn)鑒定酶活性。體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC7901，并通過(guò)不同劑量HME蛋白干預(yù)胃癌細(xì)胞VEGF、COX-2表達(dá)，HME干預(yù)劑量為1 μg/ml～5 ug/ml，分別于干預(yù)后0 h、12 h、2

4、4 h、36 h采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清及胞漿中VEGF、COX-2濃度變化，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果:SDS-PAGE及Western blot證實(shí)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出HMEad基因融合蛋白。重折疊復(fù)性后經(jīng)活性鑒定證實(shí)HMEcd基因融合蛋白具有分解明膠的酶活性。HME蛋白干預(yù)胃癌細(xì)胞36 h后，HME干預(yù)劑量在1 μg/ml～5 μg/ml時(shí)VEGF濃度均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；對(duì)照

5、組在12 h后VEGF表達(dá)明顯高于0h，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml劑量組中，干預(yù)后12 h與0 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HME、纖溶酶原聯(lián)合干預(yù)各劑量組與對(duì)照組VEGF濃度比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；HME干預(yù)胃癌細(xì)胞后COX-2表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論:成功在大腸桿菌中高效表達(dá)出HMEcd基因融合蛋白，