COX-2反義RNA與NSAIDs抑制膀胱癌細胞惡性表型的實驗研究.pdf

1、膀胱移行細胞癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，特點是極易復發(fā)，對放療及化療不敏感，而且化療藥物不能阻止膀胱癌的進展。目前腫瘤綜合治療是抗瘤治療的方向，它可使腫瘤治療的療效比單純外科治療明顯提高，同時探索腫瘤治療的新途徑一直為人們所重視。 環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(PG)和血栓烷(TXA2)的關(guān)鍵限速酶，COX-2是兩種亞型之一，是高誘導基因，可被一些細胞因子、生長因子、腫瘤促進因子、癌基因和化學致癌物激活，被認為有

2、導致腫瘤和炎癥的作用。大量研究表明，環(huán)氧化酶-2在食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等中有較高表達，并認為參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 流行病學研究顯示規(guī)律的服用非甾體抗炎藥物(NSAIDs)可降低結(jié)腸癌的危險性，其機制可能與抑制COX-2表達有關(guān)。塞來昔布(Celecoxib)是COX-2選擇性抑制劑，是唯一經(jīng)過FDA認證的可以用于家族性腺瘤息肉病的治療，但其防治腫瘤的作用機制仍然沒有完全清楚。 本

3、研究旨在探討人COX-2反義RNA及NSAIDs抑制膀胱癌細胞惡性表型的作用及其機制，以期為臨床制定腫瘤的治療方案提供理論依據(jù)。本實驗應用基因重組技術(shù)、反義核酸技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、MTT法、流式細胞術(shù)、RT-PCR、Westernblot、激光共聚焦技術(shù)及裸鼠成瘤實驗，對體內(nèi)外膀胱癌細胞增殖與凋亡，及其與COX-2蛋白表達的相關(guān)性等進行了研究。為進一步開發(fā)和應用NSAIDs打下了實驗基礎(chǔ)，主要實驗內(nèi)容及結(jié)果如下： 1、COX-2

4、反義RNA真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)導膀胱癌細胞株通過PCR方法從含有人COX-2基因的質(zhì)粒中擴增COX-2cDNA，并通過限制性內(nèi)切酶克隆于T載體(pMD18-T)EcoRⅠ和XbaⅠ位點之間，測序正確后，雙酶切獲得COX-2cDNA，并將其反向插入pcDNA3.1中完成質(zhì)粒的重組。重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/COX-2as，并通過核酸測序和限制性內(nèi)切酶消化證實重組反義COX-2真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/COX-2as正確的。

5、 應用脂質(zhì)體介導的DNA轉(zhuǎn)導技術(shù)，將pcDNA3.1/COX-2as質(zhì)粒導入T24膀胱癌細胞中。經(jīng)過G418的篩選，選出陽性克隆進行流式細胞術(shù)、間接免疫熒光染色和RT-PCR鑒定。經(jīng)3種方法的鑒定，在轉(zhuǎn)導pcDNA3/COX-2as的T24細胞中COX-2的表達明顯抑制，提示反義COX-2RNA成功的導入了T24細胞中并顯著的抑制了COX-2的活性，成功的制備了COX-2基因表達持續(xù)下調(diào)的膀胱腫瘤細胞株T24-AS。 2、C

6、OX-2反義RNA及NSAIDs抑制膀胱癌細胞惡性表型的實驗研究①實驗方法：應用MTT法、流式細胞術(shù)對研究了NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-AS細胞株體外抗增殖活性及細胞周期的影響。應用RT-PCR檢測了膀胱腫瘤T24及T24-AS細胞株凋亡相關(guān)因子Bcl-2、bax、Bak、bcl-xl及凋亡相關(guān)蛋白survivinmRNA表達。應用流式細胞儀(AnnexinV-FITC和PI熒光染色)檢測NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-

7、AS細胞株早期凋亡的影響。應用Westernblot檢測NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-AS細胞株COX-2蛋白表達的影響。 ②結(jié)果：膀胱癌T24-AS較T24細胞株增殖活性明顯受到抑制，提示COX-2表達與腫瘤細胞增殖呈正相關(guān)；IN和Celecoxib對膀胱癌細胞均有明顯的抗增殖作用，并能使細胞周期G0/G1期比例明顯升高，而塞來昔布對T24-AS的作用最強。膀胱T24及T24-AS細胞株凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、

8、Bak、Bcl-xl表達無明顯差異，與流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)T24及T24-AS凋亡率無明顯差異相吻合，說明COX-2表達水平與細胞增殖活性相關(guān)，而與細胞凋亡無明顯相關(guān)性。IN和Celecoxib對膀胱腫瘤T24及T24-AS細胞株具有明顯促進其凋亡的作用，存在劑量依賴性，選擇性COX-2抑制劑Celecoxib作用更強。膀胱腫瘤T24-AS較T24細胞株COX-2蛋白表達明顯下調(diào)，但IN和Celecoxib能更進一步的抑制其表達，Celec

9、oxib作用更強，說明選擇性和非選擇性COX-2抑制劑均有相同的抑制COX-2表達的作用。選擇性和非選擇性COX-2抑制劑對膀胱癌細胞有明顯的抗增殖和促進凋亡作用，其促進凋亡作用與COX-2表達無明顯相關(guān)性，其促進凋亡作用可能主要是通過COX-2非依賴性途徑完成的。Celecoxib對膀胱癌細胞具有更強的抗增殖和促進凋亡作用。 3、COX-2與NSAIDs對膀胱癌細胞株裸鼠成瘤作用的影響①實驗方法：裸鼠成瘤性實驗，觀察NSAID

10、s對裸鼠成瘤性的影響；應用免疫組化、RT-PCR、westernblot技術(shù)以及形態(tài)學檢測移植瘤凋亡與COX-2表達。 ②結(jié)果：本實驗主要研究了COX-2及NSAIDs在體內(nèi)對膀胱癌細胞株的作用。NSAIDs干預組與T24-AS組裸鼠移植瘤中COX-2表達明顯降低；NSAIDs和COX-2反義RNA能抑制膀胱癌T24細胞株裸鼠移植瘤的生長，IN和Celecoxib對裸鼠移植瘤成瘤均有抑制作用，而Celecoxib作用更強；光鏡與

11、電鏡顯示T24-AS組與NSAIDs藥物干預組腫瘤細胞凋亡明顯增加；IN和Celecoxib對裸鼠移植瘤生長的作用可能是通過抑制腫瘤細胞增殖與促進其凋亡。 綜上所述，我們探討了COX-2反義RNA與NSAIDs在體內(nèi)外抑制膀胱癌細胞惡性表型，結(jié)論如下： 一、膀胱癌細胞COX-2基因表達下調(diào)及NSAIDs的干預能明顯抑制細胞增殖活性，COX-2表達與細胞增殖活性呈正相關(guān)關(guān)系，而與細胞凋亡無明顯相關(guān)性。 二、細胞與在

12、體實驗均證實IN和Celecoxib對膀胱腫瘤T24及T24-AS細胞株具有明顯促進其凋亡的作用，存在劑量依賴性，Celecoxib作用更強。 三、細胞與在體實驗均證實IN和Celecoxib能進一步抑制膀胱腫瘤T24-AS的COX-2表達，對其有雙重阻斷作用。 四、選擇性和非選擇性COX-2抑制劑對膀胱癌細胞有明顯的抗增殖和促進凋亡作用，其促進凋亡作用與COX-2表達高低無明顯相關(guān)性，提示主要是通過COX-2非依賴性途