腦血管痙攣中縫隙連接蛋白Cx43磷酸化信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　紅細(xì)胞溶解釋放的OxyHb是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后引起腦血管痙攣(CVS)的關(guān)鍵因素。同樣縫隙連接（gap junction GJ）蛋白重構(gòu)與眾多心腦血管疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。磷酸化是GJ發(fā)生重構(gòu)的最主要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)是前期研究的延續(xù)，研究Cx43及其Ser368和Ser262磷酸化水平在CVS中的表達(dá)變化及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;進(jìn)一步深入研究腦血管GJ通道參與SAH后CVS的分子機(jī)制，可能為CVS的藥物防治尋找到

2、一個(gè)全新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、原代培養(yǎng)大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、免疫熒光鑒定，并觀察大鼠基底動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞Cx43、Cx40的表達(dá)和分布，構(gòu)建CVS細(xì)胞模型:開顱取大鼠基底動(dòng)脈，組織貼塊法培養(yǎng)大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，形態(tài)學(xué)及免疫熒光鑒定;免疫熒光、共聚焦顯微鏡觀察Cx43、Cx40在大鼠基底動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞的表達(dá)和分布;加入10-6M OxyHb孵育平滑肌細(xì)胞建立CVS細(xì)胞模型。
　　2、激光共聚焦顯微鏡觀察腦

3、血管痙攣細(xì)胞模型中加入PKC、MAPK及PTK等抑制劑后P-Cx43-S368、P-Cx43-S262及Cx43表達(dá)變化:各試驗(yàn)組分別加入溶媒、OxyHb、OxyHb和PKC抑制劑白屈菜季安堿、OxyHb和MAPK抑制劑PD98059、OxyHb和PTK抑制劑PP2，孵育12、24、48小時(shí)，三重免疫熒光著色，共聚焦顯微鏡觀察Cx43、P-Cx43-S368及P-Cx43-S262的表達(dá)變化。
　　3、Western blotti

4、ng分析上述各組P-Cx43-S368、P-Cx43-S262及Cx43蛋白表達(dá)時(shí)相性變化。
　　結(jié)果:
　　1、成功培養(yǎng)出大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，縫隙連接蛋白Cx43、Cx40在基底動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞表達(dá)豐富，且在生理狀態(tài)下Cx40表達(dá)量明顯多于Cx43;
　　2、基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)OxyHb刺激12h、24h、48h后，共聚焦顯微鏡及Western blotting技術(shù)觀察到P-Cx43-S368、P-Cx43-S

5、262及Cx43總蛋白表達(dá)顯著升高，并呈時(shí)相性變化(P＜0.05);
　　3、分別應(yīng)用PKC抑制劑白屈菜季安堿、MAPK抑制劑PD98059及PTK抑制劑PP2，可顯著抑制OxyHb誘導(dǎo)的P-Cx43-S368、P-Cx43-S262及Cx43總蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1、生理狀態(tài)下縫隙連接蛋白Cx43、Cx40在基底動(dòng)脈及平滑肌細(xì)胞豐富表達(dá)，且Cx40表達(dá)明顯多于Cx43;
　　2、Oxy

6、Hb誘導(dǎo)的CVS細(xì)胞模型中，致痙因子可能直接或間接進(jìn)入局部血管平滑肌細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)PKC、MAPK、PTK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，升高Cx43總蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Cx43的Ser368和Ser262磷酸化水平，調(diào)節(jié)GJ功能，使GJ選擇性傳輸某些電、化學(xué)信號(hào)，最終誘導(dǎo)彌漫性持續(xù)性的CVS發(fā)生發(fā)展。阻斷PKC、MAPK、PTK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以降低Cx43總蛋白表達(dá)，阻斷Cx43的Ser368和Ser262過磷酸化，顯著緩解OxyHb誘導(dǎo)的CVS，為