山羊卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存液配方篩選研究.pdf

1、卵母細(xì)胞作為胚胎工程、核移植、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)研究的試驗(yàn)材料被廣泛應(yīng)用。卵母細(xì)胞冷凍保存不但可以使卵母細(xì)胞的供給不受時(shí)間和空間的限制，而且對(duì)保護(hù)品種資源、促進(jìn)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的商業(yè)化具有重要意義。為獲得保存山羊體外成熟卵母細(xì)胞的優(yōu)化玻璃化液配方，本試驗(yàn)開展了玻璃化液配方篩選研究。玻璃化液配方1、2、3、4、5和6所含滲透性抗凍保護(hù)劑濃度分別為30％EG、27.5％EG+2.5％DMSO 、 25％EG+5％DMSO 、 20％EG+10％D

2、MSO 、15％EG+15％DMSO和40％EG。將體外成熟的山羊卵母細(xì)胞分為3組：(1)對(duì)照組，卵母細(xì)胞不進(jìn)行處理；(2)毒性組，卵母細(xì)胞在玻璃化液中進(jìn)行暴露但不投入液氮中冷凍；(3)冷凍組，卵母細(xì)胞利用OPS法進(jìn)行玻璃化冷凍。毒性組和冷凍組卵母細(xì)胞在濃度遞減的蔗糖溶液中脫除抗凍保護(hù)劑。各處理對(duì)卵母細(xì)胞存活率、孤雌激活率、體外受精能力及胚胎發(fā)育能力的影響結(jié)果如下： 不同配方的玻璃化液對(duì)卵母細(xì)胞存活率影響的研究結(jié)果：卵母細(xì)胞經(jīng)玻

3、璃化液處理后，玻璃化液1.6組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率(97.1％、97.0％、97.0％、96.3％、98.1％、96.7％)與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；但在發(fā)育液培養(yǎng)15-17h后，玻璃化液6(EFS40)組的卵母細(xì)胞死亡率達(dá)54.1％，與對(duì)照組(0.0％)差異顯著(P<0.05)，玻璃化液1-5組卵母細(xì)胞與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。根據(jù)上述研究結(jié)果，對(duì)玻璃化液6予以淘汰。 不同配方的玻璃化液對(duì)卵母細(xì)胞孤雌激

4、活作用的研究結(jié)果：玻璃化液4、5對(duì)卵母細(xì)胞的孤雌激活率分別為7.5％和9.0％，與對(duì)照組(0.0％)差異顯著(P<0.05)；玻璃化液1、2、3組的孤雌激活率分別為1.0％、2.7％、3.5％，與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。因此，對(duì)玻璃化液4、5予以淘汰。 玻璃化液1、2、3冷凍保存對(duì)卵母細(xì)胞受精能力的影響研究結(jié)果：卵母細(xì)胞在玻璃化液2中暴露后的正常受精率(31.8％)與對(duì)照組(51.2％)無顯著性差異(P>0.05)，

5、在玻璃化液1、3中暴露的正常受精率(29.2％、29.3％)均較對(duì)照組(51.2％)顯著降低(P<0.05)；玻璃化液2冷凍保存卵母細(xì)胞的正常受精率(28.0％)較對(duì)照組(51.2％)顯著降低(P<0.05)，而玻璃化液1、3冷凍保存卵母細(xì)胞的正常受精率(22.73％、22.45％)則較對(duì)照組極顯著降低(P<0.01)。以24h卵裂數(shù)/48h卵裂數(shù)為卵裂速度參數(shù)，玻璃化液1、2的毒性組卵裂速度(51.9％和50.0％)與對(duì)照組(77.1

6、％)之間差異顯著(P<0.05)；玻璃化液1、2、3毒性組和冷凍組卵母細(xì)胞的酶溶解透明帶時(shí)間(424.0s～434.9s)較對(duì)照組(380.1s)顯著增加(P<0.05)。 玻璃化液1、2、3對(duì)卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育能力的影響研究的結(jié)果：在體外受精胚胎的發(fā)育能力方面，玻璃化液1、2、3的毒性組桑椹胚率(37.0％、50.0％、37.5％)與對(duì)照組的桑椹胚率(58.3％)無顯著性差異(P>0.05)，玻璃化液1、2、3的各冷凍組桑椹胚率

7、(25.0％、33.3％、32.1％)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；體外受精胚胎囊胚發(fā)育率與對(duì)照組(27.1％)比較，玻璃化液2、3的毒性組(9.4％、9.4％)無顯著性差異(P>0.05)，其它組囊胚發(fā)育率顯著降低(P<0.05)。在孤雌激活胚胎發(fā)育能力方面，玻璃化液2的毒性組卵裂率和桑椹胚發(fā)育率(69.2％和53.3％)與對(duì)照組(80.0％、54.1％)無顯著性差異(P>0.05)，但冷凍組的卵裂率和桑椹胚率(61.4％、32.