大口黑鱸Myf5基因結(jié)構(gòu)分析和對魚類肌肉生長作用的研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容如下： 1.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了大口黑鱸Myf5 cDNA序列1093bp，其中開放閱讀框長723bp,編碼240個氨基酸，3’非翻譯區(qū)長370bp，存在轉(zhuǎn)錄終止序列ATTAAA。經(jīng)分析該蛋白無信號肽序列，屬核蛋白，含有一典型的堿性螺旋一環(huán)一螺旋結(jié)構(gòu)域。大口黑鱸Myf5基因氨基酸序列與14種脊椎動物相比同源性介于56％-93％之間。其中bHLH結(jié)構(gòu)域與其他魚類相比同源性可達到90％以上，與人、鼠、牛、

2、雞、非洲爪蟾相比也有82％以上的同源性，在不同的物種中呈現(xiàn)出較高的保守性，序列高度的保守性與其重要的生物學功能有關(guān)。 2.應(yīng)用高保真PCR技術(shù)，設(shè)計特異引物分離得到該基因基因組序列，再與已獲得的ORF序列進行比對，確認外顯子與內(nèi)含子邊界。該基因共存在三個外顯子與兩個內(nèi)含子，外顯子1、2、3分別長453bp，73bp和197bp。內(nèi)含子1，2分別長920bp和328bp，內(nèi)含子與外顯子邊界均符合GT-AG規(guī)則。通過大口黑鱸、條紋

3、鱸、褐牙鲆和斑馬魚的基因組序列比對，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1中存在123bp魚類中同源性為86％的保守序列，推測它可能在對Myf5基因的時空和組織特異性表達過程中起到調(diào)節(jié)作用。 3.應(yīng)用基因組步移(Genome Walker)技術(shù)，根據(jù)外顯子1序列設(shè)計引物，分離得到啟動調(diào)控區(qū)2690bp。應(yīng)用生物信息學軟件預(yù)測存在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件TATA框、GC框、CCAAT框(核轉(zhuǎn)錄因子NFY能對該序列進行調(diào)控)和八聚體轉(zhuǎn)錄因子1(Otc-1)結(jié)合位

4、點。存在與肌肉特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的元件有E-box 18個、肌細胞特異增強因子2(Myocyte specific enhancer factor2，MEF2)結(jié)合位點3個、上游激活因子(Upstream stimulating factor，USF)結(jié)合位點2個、血清應(yīng)答因子(Serum response factor，SRF)結(jié)合位點2個、核轉(zhuǎn)錄因子sp1結(jié)合位點8個、肌肉特異性金屬硫蛋白MTBF(Muscle-specific M

5、t binding site factor)結(jié)合位點3個。與早期誘導(dǎo)肌肉分化信號有關(guān)的調(diào)控元件有早期生長應(yīng)答因子α(Early growth response gene α，EGRα/TIEG)結(jié)合位點、早期快反應(yīng)生長應(yīng)答因子1(Early growth response gene 1，Egr-1/Krox-24)結(jié)合位點、早期快反應(yīng)生長應(yīng)答因子2(Early growth response gene 2，Egr-2/Krox-20)結(jié)

6、合位點、生長依賴因子l(Growth factor independence 1)結(jié)合位點、T細胞因子TCF/LEF-1結(jié)合位點，這些轉(zhuǎn)錄因子可能是調(diào)控Myf5基因在體節(jié)形成期早期表達的主要因子。 4.將Myf5基因的ORF定向克隆至pcDNA3.1(-)/mycHisB載體，構(gòu)建真核重組表達載體pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5，溶于生理鹽水，肌肉注射法注入羅非魚右側(cè)背部肌肉作為實驗組，左側(cè)背部肌肉注射pcDNA

7、3.1(-)/mycHisB質(zhì)粒作為對照組，RT-PCR和免疫組化實驗證實外源Myf5:mycHis基因已在肌肉組織中局部表達，對照組肌肉組織無外源基因表達。 5.肌注60天后，應(yīng)用石蠟組織切片技術(shù)對實驗組與對照組注射部位肌肉組織塊進行比較觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組白肌肌纖維直徑較對照組有顯著變化，實驗組白肌肌纖維直徑平均增大9％，單位面積上肌纖維數(shù)量減少，然而紅肌的肌纖維密度與直徑并無顯著變化，是否紅肌中的肌肉前體細胞存在不同的信號調(diào)控