大口黑鱸EST數(shù)據(jù)庫(kù)分析及與生長(zhǎng)相關(guān)的分子標(biāo)記篩選.pdf

1、大口黑鱸是遺傳研究和基因信息比較缺乏的物種。目前大口黑鱸可利用的有效標(biāo)記數(shù)量有限,建立表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù),為SSR和SNP的開發(fā)提供了新的途徑。本研究應(yīng)用高通量羅氏454測(cè)序技術(shù)對(duì)大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并建立ESTs數(shù)據(jù)庫(kù),并以文庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行大口黑鱸SSR和SNP的篩選及生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、大口黑鱸兩個(gè)亞種EST數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建和分析
　　應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)

2、Roche454對(duì)大口黑鱸北方亞種(M. salmoides salmoides)和佛羅里達(dá)亞種(M. salmoides floridanus)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并建立ESTs數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)果得到北方亞種ESTs序列468671條,佛羅里達(dá)亞種ESTs序列332322條,兩亞種ESTs序列的平均長(zhǎng)度分別為306.5bp和304.4bp。將得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行拼接,大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種共得到contig序列總數(shù)分別為42056條和35

3、743條,平均長(zhǎng)度分別是612.6bp和588.2bp。將大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種的數(shù)據(jù)庫(kù)合并,通過與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后,共78938條EST序列被注釋,根據(jù)Gene Ontology(GO)信息,對(duì)序列按照分子功能、細(xì)胞組成、生物學(xué)過程進(jìn)行分類。通過對(duì)大口黑鱸合并的EST庫(kù)信息進(jìn)行大通量SSR和SNP位點(diǎn)的發(fā)掘,發(fā)現(xiàn)了含SSRs和SNPs的序列分別是25469和8547條。從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取75條contigs進(jìn)行北方亞種和

4、佛羅里達(dá)亞種的序列比較,結(jié)果表明兩個(gè)亞種EST序列同源性為99.2％。
　　2、大口黑鱸EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)
　　選取133條SSRs序列并設(shè)計(jì)引物,其中15對(duì)能夠擴(kuò)增出帶型清晰且有多態(tài)性的譜帶。用這15對(duì)引物分析大口黑鱸微衛(wèi)星的多態(tài)性,結(jié)果表明:每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2-5個(gè),平均等位基因是2.533個(gè),觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的范圍分別為0.150-0.857(平均0.480)和0.262-0.7

5、39(平均0.550),平均多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.261-0.740(平均0.384)。Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明15個(gè)位點(diǎn)中只有一個(gè)位點(diǎn)(Contig44566)嚴(yán)重偏離了平衡。
　　3、大口黑鱸SNP的篩選及載脂蛋白部分序列上SNP多態(tài)性與生長(zhǎng)相關(guān)的分析
　　根據(jù)大口黑鱸EST庫(kù)中的載脂蛋白、激活素、鋅指蛋白等生長(zhǎng)代謝基因的10個(gè)片段設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增,結(jié)果共得到了14個(gè)SNP位點(diǎn)。為進(jìn)一步

6、研究其中載脂蛋白(載脂蛋白A1、載脂蛋白A4和載脂蛋白C1)基因上的SNP位點(diǎn),將其在另外一個(gè)群體中進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明大口黑鱸載脂蛋白A1基因上有1個(gè)顛換SNP位點(diǎn):A+489C;載脂蛋白A4上篩到1個(gè)轉(zhuǎn)換SNP位點(diǎn):A+633T;載脂蛋白C1上篩到2個(gè)顛換SNP位點(diǎn):A+24G和A+75C。采用SnapShot的方法分別對(duì)同一群體的159尾大口黑鱸的這4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和分型,統(tǒng)計(jì)基因型頻率,并利用一般線性模型分析4個(gè)SNPs位點(diǎn)與大口