促進(jìn)rAAV在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA篩選及機(jī)制初探.pdf

1、研究背景
　　近年來(lái),基因治療取得長(zhǎng)足的進(jìn)展,全世界已有上千例基因治療研究進(jìn)入臨床試驗(yàn),治療的范圍已從遺傳病領(lǐng)域擴(kuò)展到癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染病(包括AIDS)等領(lǐng)域。然而,呈遞基因藥物的載體的局限性阻礙了基因治療的發(fā)展。
　　rAAV(Recombinant Adeno-associated Virus)基因藥物載體這一后起之秀格外引人注目,腺相關(guān)病毒屬于細(xì)小病毒家族,具有宿主范圍廣、非致病性、能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外

2、源基因等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是最有前景的基因治療載體之一。
　　一些臨床研究的問(wèn)題如血友病基因治療中AAV2外殼啟動(dòng)了CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性,缺陷、帕金森病的臨床試驗(yàn)被證明基本無(wú)效,對(duì)rAAV載體的表達(dá)效率提出了更高要求。
　　一些治療基因,在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí),還可提高載體的表達(dá)效率。2009年Johnson等研究發(fā)現(xiàn),siRNA介導(dǎo)的沉默機(jī)制使rAAV載體的表達(dá)效率最高可提高15倍和30倍。2011

3、年Wallen等從5520個(gè)siRNA文庫(kù)中篩選出50個(gè)能提高rAAV表達(dá)至8倍的siRNA。
　　以上研究為本論文提供了良好的借鑒。miRNA是一類長(zhǎng)約22nt的小片段RNA分子,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。它的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,尤其是在肺癌中的影響,引起強(qiáng)烈關(guān)注,并得到大量研究。
　　研究目的
　　本論文將探索miRNA在以rAAV作為載體的基因治療中的作用,在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446細(xì)胞系中高通

4、量篩選miRNA文庫(kù)以發(fā)現(xiàn)促進(jìn)rAAV表達(dá)的miRNA序列并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)明星 miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)和信號(hào)通路預(yù)測(cè),探索其作用機(jī)理,為rAAV-miRNA的基因藥物的研究打開(kāi)一扇門。
　　研究方法
　　(1)細(xì)胞培養(yǎng),建立NCI-H446細(xì)胞系;
　　(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染EGFP siRNA和EGFP質(zhì)粒以評(píng)估和建立良好的轉(zhuǎn)染體系;
　　(3)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染包含近2000條序列的miRNA文庫(kù);

5、　　(4)轉(zhuǎn)染rAAV-GLUC病毒,以GLUC熒光表達(dá)量來(lái)衡量rAAV的表達(dá)水平;
　　(5)用腔腸素(coelenterazine)配制工作液來(lái)檢測(cè)GLUC熒光強(qiáng)度;
　　(6) MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染體系中細(xì)胞增殖及活力;
　　(7)用穩(wěn)健型Z評(píng)分,四分位法等統(tǒng)計(jì)學(xué)算法對(duì)篩選數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)和結(jié)果鑒定,挑選出可以提高rAAV轉(zhuǎn)染效率的miRNA;
　　(8)使用生物信息學(xué)軟件如Targetscan,Pictar