Twist在肺癌中高表達并與肺癌的分化有關(guān).pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子Twist是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)過程中的重要調(diào)控因子，在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。上皮間質(zhì)化是腫瘤進展的重要過程，Twist被認為通過調(diào)節(jié)E—cadherin的表達通過EMT途徑調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而Twist在腫瘤進展中的具體作用仍不清。本研究采用肺癌組織標本，檢測Twist在肺癌組織中的表達水平，及其與臨床病理因素的關(guān)系，同時檢測Twist蛋白和Twist1、Twist2的mRNA在多種肺癌細胞系中的表達，深入研究Twist

2、與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 材料和方法: 一、病例和材料 收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2000年11月至2006年4月間手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的68例肺腺癌和肺鱗癌標本，其中男性40例，女性28例，患者平均年齡59歲；所有病例術(shù)前均未接受過放化療及免疫治療，取例癌旁正常肺組織作為對照。細胞系用含15％胎牛血清的RPMI—1640培養(yǎng)基，其它細胞都用含10％FBS的RPMI—1640培養(yǎng)基，pH值保持在7.2～7.4之間

3、，于含5％ CO2的37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。 二、試劑 Twist兔抗人多克隆抗體Twist(H—81)購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒(KIT—9710)和DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新生物技術(shù)公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver．3.0購自大連寶生物(TaKaRa)公司，RPM

4、I—1640購自GIBCO公司。 三、方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測肺癌組織及癌旁正常肺組織中Twist的表達。染色方法按SP免疫組化試劑盒說明書進行，經(jīng)檸檬酸(pH=6.0)微波抗原修復(fù)。每張切片在光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)，然后取平均值。染色強度分級為：陰性為0，淡黃色為1，黃棕色為2，深棕色為3。以陽性腫瘤細胞數(shù)分級：<5％為0.5％～25％為1，2

5、5％～50％為2，>50％為3。利用染色強度與陽性腫瘤細胞數(shù)乘積來評定結(jié)果，0為陰性，1為弱陽性，2～4為陽性，6～9為強陽性。電泳成像后進行分析光密度值。將Twist1、Twist2的光密度值與GAPDH光密度值的比值作為Twist1、Twist2的相對表達量進行比較分析。 四、統(tǒng)計分析方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS for Windows13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，對Twist的表達與臨床病理特征的關(guān)系采用兩組資料非

6、參數(shù)檢驗和多組資料非參數(shù)秩和檢驗，Twist在細胞系中的表達采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果: 一、免疫組化 68例肺鱗癌和腺癌組織中，有8例為Twist陰性(11.76％)，9例為Twist弱表達(13.24％)，28例Twist表達(41.18％)，有23例Twist高表達(33.82％)(圖1)。Twist在8例癌旁肺組織中弱表達。Twist的表達情況與肺癌的分化程度(P=0.002)和

7、肺癌患者的年齡(P=0.012)相關(guān)。Twist的表達水平與患者的性別(P=0.820)、組織學(xué)類型(P=0.426)、TNM分期(P=0.200)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.392)關(guān)系并不顯著。 二、RT-PCR Twist1和Twist2的mRNA在HBE和8種肺癌細胞系中的表達并不一致(圖2)。Twist1在HBE表達，在不同組織學(xué)類型的癌細胞系之間比較，Twist1在在肺腺癌A549表達最高，在肺鱗癌SK細胞系中

8、表達較A549少；在肺大細胞癌460和661和肺巨細胞癌LH7和BE1細胞系中的表達水平基本相同，表達水平較低；在肺小細胞癌446細胞系中表達水平較A549低。Twist2在HBE表達，但較Twist1表達水平低，在不同組織學(xué)類型的癌細胞系之間比較，Twist2在肺鱗癌細胞系SK中表達較高，肺腺癌A549和LTE中表達較SK少；在肺大細胞癌460和661和肺巨細胞癌LH7和BE1細胞系中的表達水平基本相同，表達水平較低；在肺小細胞癌44

9、6細胞系中表達水平較高。其次在同種組織學(xué)類型的不同細胞系中比較，Twist2 mRNA在A549的表達低于LTE；在460、661兩種細胞系中表達水平也較為一致；在LH7和BE1細胞系表達水平也無明顯差別。 三、免疫熒光 在人支氣管上皮HBE細胞系中，Twist弱表達，Twist蛋白在不同肺癌細胞系中表達水平不同(圖3～圖8)，在肺腺癌LTE和A549細胞系和肺鱗癌SK中表達較強，大細胞癌460和661熒光強度比腺癌和鱗

10、癌弱，Twist蛋白表達定位以細胞漿為主。 結(jié)論: 在癌旁肺組織中Twist弱表達，肺鱗癌和肺腺癌組織中Twist較高表達。Twist的表達情況與肺癌的分化程度相關(guān)，低分化的肺癌Twist高表達，中高分化的肺癌其陽性表達，這表明Twist可能在肺癌發(fā)生中起重要作用。Twist的mRNA表達在肺鱗癌和腺癌細胞系中均高于HBE。在蛋白水平，Twist的表達在肺鱗癌和腺癌細胞系中均高于HBE，表達于細胞漿。我們的研究提示Twi