As2O3聯(lián)合Canstatin基因治療對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：以As2O3、Canstatin及二者聯(lián)合方案分別干預(yù)三維培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞，觀察各干預(yù)因素對(duì)血管生成擬態(tài)（VM）形成能力（VM數(shù)量、長度及面積）的影響，探討其影響機(jī)制，為抗肝癌血管形成提供新策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴CCK-8法確定As2O3（1、5、10、15、20μmol/L）對(duì)HepG2細(xì)胞的最適作用劑量；⑵RT-PCR法鑒定重組腺病毒；⑶流式細(xì)胞術(shù)檢測不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI=10、20、40、60、80）的

2、腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞（24h、48h、72h）的轉(zhuǎn)染率，western-blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Canstatin和Caspase-3蛋白的表達(dá)；⑷體外基質(zhì)膠三維培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，PAS染色法鑒定VM；⑸不同干預(yù)因素對(duì)HepG2細(xì)胞形成VM的影響，實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、As2O3組(1/2IC50、IC50、2IC50)、Canstatin組、As2O3(1/2IC50、IC50)與Canstatin聯(lián)合組，各因素干預(yù)體外培養(yǎng)細(xì)胞12h后

3、種膠，分別于種膠0.5h、2h、12h、24h、48h、72h倒置顯微鏡觀察下拍照，記錄測量VM（環(huán)狀結(jié)構(gòu)）的數(shù)量、長度及面積。⑹RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞中VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達(dá)；⑺Western-blot檢測各因素干預(yù)體外培養(yǎng)細(xì)胞12h后VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①經(jīng)SPSS17.0軟件計(jì)算得出As2O3作用HepG2細(xì)

4、胞72h的半數(shù)抑制濃度IC50(10μmol/L)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)最適用藥劑量；②PCR產(chǎn)物測序序列識(shí)別為人Canstatin基因；③確定2次、48h，MOI=80為后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染方式。Western-blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Canstatin的表達(dá)為強(qiáng)陽性，Caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組沒有差異；④三維培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞種膠2h后開始變形、延伸并相互連接，12h時(shí)相鄰的細(xì)胞相互聚集成明顯的條索樣結(jié)構(gòu)，72h時(shí)邊緣逐漸光滑，細(xì)胞開始向上堆積生長，PA

5、S染色后HepG2細(xì)胞形成的環(huán)狀條索樣結(jié)構(gòu)被染成紫紅色；⑤不同方案處理細(xì)胞三維培養(yǎng)72h后，倒置顯微鏡50倍視野下拍照，圖片應(yīng)用IPP軟件計(jì)算VM的長度、數(shù)量和面積，統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，VM的長度、數(shù)量和面積，在1/2IC50組分別為4.90±0.91，22.00±9.17，0.177±0.013，IC50組分別為2.70±1.04，2.00±1.41，0.079±0.006，與對(duì)照組8.34±0.91，48.67±8.08，0.309

6、±0.017比較P<0.01，1/2IC50組與IC50組比較P<0.05；Canstatin與As2O3聯(lián)合組能夠抑制VM，與對(duì)照組比較P<0.05，但聯(lián)合組與As2O3組比較P>0.05；Canstatin組與對(duì)照組比較P>0.05；⑥PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，細(xì)胞中存在VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達(dá)；⑦western-blot結(jié)果顯示，1/2IC50組VE-cadherin相對(duì)表達(dá)量為1.79

7、±0.13，IC50組為0.62±0.06，與對(duì)照組2.56±0.13比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，1/2IC50組與IC50組MMP-2的相對(duì)表達(dá)量1.96±0.09、1.10±0.03與對(duì)照組2.79±0.13相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，而凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和增殖相關(guān)蛋白PCNA的相對(duì)表達(dá)沒有差異P>0.05，Canstatin組各蛋白的相對(duì)表達(dá)與對(duì)照組相比P>0.05，聯(lián)合組能抑制VE-cadherin、MM