納米藥物載體對(duì)人樹突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、納米技術(shù)在藥物載體領(lǐng)域的運(yùn)用催生了一大批納米藥物載體。由于納米粒子具有的獨(dú)特性質(zhì)，納米藥物載體表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能。 現(xiàn)在，已經(jīng)有多種納米藥物載體參與疫苗的設(shè)計(jì)與制備并取得良好效果。 納米疫苗起效的首要因素是抗原提呈細(xì)胞（APC）對(duì)納米藥物的攝取和遞呈。雖然納米疫苗的有效成分為抗原蛋白、多肽或編碼抗原的基因，但納米藥物載體本身亦被APC攝取，此過程中可能會(huì)對(duì)APC的活性與功能產(chǎn)生一定影響。納米乳劑與納米脂質(zhì)體

2、作為納米藥物載體都有著廣泛的應(yīng)用前景，我實(shí)驗(yàn)室已在前期研究中制備了納米乳劑及納米脂質(zhì)體包裹腫瘤特異性抗原的腫瘤納米疫苗，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果。但在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)納米乳劑在動(dòng)物體內(nèi)可能有一定毒性，當(dāng)達(dá)到一定用藥量后與對(duì)照組相比，乳劑組的小鼠死亡率明顯增高。DC作為抗原遞呈能力最強(qiáng)、唯一可誘導(dǎo)靜止T細(xì)胞活化的APC越來越受到人們重視。以DC為靶向的納米疫苗藥物載體已成為納米醫(yī)藥領(lǐng)域研究的新方向，特別是在腫瘤免疫中，利用納

3、米藥物載體將腫瘤特異性抗原靶向輸送給DC，通過DC的加工將抗原肽遞呈到- 3 -表面MHC-Ⅰ類分子上，激活下游的CD8+T細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)腫瘤特異性抗原的CTL克隆，最終發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道納米藥物載體對(duì)人DC的毒性作用和活性影響。本研究首先建立了人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）來源DC和粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動(dòng)員人外周血干細(xì)胞（PBSC）來源DC的培養(yǎng)方法。在此基礎(chǔ)上，以形態(tài)學(xué)為主要研究手段，研究了納米乳

4、劑及納米脂質(zhì)體在體外對(duì)人PBMC來源樹突狀細(xì)胞的影響。 本研究主要內(nèi)容有： 1．人PBMC 及PBSC 來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 目的：改進(jìn)人PBMC分離培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的方法，以獲得數(shù)量與純度更高的樹突狀細(xì)胞。建立經(jīng)G-CSF動(dòng)員PBSC來源DC的培養(yǎng)方法。方法：利用連續(xù)貼壁法分離獲得人外周血來源CD14+前體細(xì)胞，經(jīng)粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘

5、導(dǎo)產(chǎn)生成熟DC。骨髓移植健康供者在G-CSF動(dòng)員4d后，Cobe SpectraTM血細(xì)胞分離機(jī)分離獲得PBSC，以其為前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生DC。流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)兩種來源DC表面標(biāo)志物表達(dá)水平，透射電鏡(TEM)和掃描電鏡（SEM）觀察PBMC來源DC的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：連續(xù)貼壁法體外分離培養(yǎng)人PBMC來源DC，所獲得DC數(shù)量和純度均高于以往一次貼壁分離培養(yǎng)的DC。在GM-CSF、IL-4 以及TNF-α的聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后

6、，DC高表達(dá)CD1a(44.16％)、CD40(75.04％)、HLA-DR(95.98％)、CD83(57.25)、CD86(73.20％)。SEM觀察到DC 典型形態(tài)：細(xì)胞直徑多在10μm以上，表面微絨毛豐富，從胞體輻射狀伸出數(shù)個(gè)粗細(xì)不等的突起。TEM觀察可見：DC胞漿內(nèi)溶酶體豐富，Golgi復(fù)合體發(fā)達(dá)，還可見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）及其周圍分布的豐富的線粒體（Mit）。 細(xì)胞核不規(guī)則，常偏于一側(cè)。培養(yǎng)第15dDC還觀察到明顯

7、的凋亡與吞噬現(xiàn)象。 經(jīng)G-CSF動(dòng)員PBSC誘導(dǎo)培養(yǎng)所獲得DC的數(shù)量更多，5ml富集PBSC的分離液- 4 -可培養(yǎng)超過107個(gè)DC，PBSC來源DC誘導(dǎo)培養(yǎng)所需時(shí)間較PBMC來源DC長(zhǎng)2-3d，培養(yǎng)過程中消耗更多細(xì)胞因子，所獲得DC高表達(dá)CD1a(48.73％)、CD40(85.04％)、HLA-DR(91.12 ％)、CD83(55.11％)和CD86(80.10％)，其表型與形態(tài)與PBMC來源DC無明顯差異。結(jié)論：在傳統(tǒng)方

8、法的基礎(chǔ)上，建立了連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)PBMC來源的DC。與傳統(tǒng)方法相比，改進(jìn)后的方法可分離培養(yǎng)數(shù)量較大、純度較高的人PBMC來源DC。同時(shí)建立了G-CSF動(dòng)員及細(xì)胞分離機(jī)分離PBSC誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生DC的方法，此方法雖然培養(yǎng)周期較長(zhǎng)且費(fèi)用高，但獲得DC數(shù)量非常多，血液其他成分浪費(fèi)少，應(yīng)用前景廣闊。 2．納米乳劑/納米脂質(zhì)體對(duì)DC 的影響 目的：了解納米乳劑/納米脂質(zhì)體對(duì)人DC的影響。 方法：人PBMC來源DC培養(yǎng)5d

9、后，將不成熟DC分別負(fù)載不同濃度納米乳劑/納米脂質(zhì)體，孵育48h，光鏡觀察DC形態(tài)變化，F(xiàn)CM檢測(cè)DC表面分子表達(dá)，TEM觀察DC攝取納米藥物載體后形態(tài)與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。MTT檢測(cè)負(fù)載納米微粒的DC對(duì)自體T淋巴細(xì)胞的促增殖能力。 結(jié)果： ①納米乳劑組：在1×10 5 /1ml DC中加入100μl納米乳劑后，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)DC發(fā)生嚴(yán)重水腫，最終崩解壞死。在1×105 /ml DC中加入納米乳劑20-50μl，光鏡下觀察D

10、C腫脹，TEM顯示大部分DC發(fā)生細(xì)胞水腫，胞內(nèi)各種細(xì)胞器均發(fā)生擴(kuò)張，胞核變大，水腫細(xì)胞內(nèi)有脂滴樣物質(zhì)，部分細(xì)胞胞膜斷裂甚至壞死崩解。在1×105 /ml DC中加入10μl乳劑，光鏡下細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，TEM僅見細(xì)胞攝取納米乳劑后形成的吞噬溶酶體。FCM檢測(cè)顯示負(fù)載10μl納米乳劑后，DC表面CD83 表達(dá)量上調(diào)。MTT結(jié)果顯示，當(dāng)納米乳劑劑量達(dá)到20μl后，DC促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力明顯下降。 ②納米脂質(zhì)體組：在1×105

11、 /ml DC中加入50 或100μl的納米脂質(zhì)體后，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變圓，表面樹枝樣突起減少，TEM顯示DC內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積，部分細(xì)胞內(nèi)有膽固醇結(jié)晶，但未見細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡。FCM檢測(cè)顯示：DC表面分子CD83 表達(dá)量未見變化，其促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力也無明顯變化。結(jié)論：適宜劑量的納米乳劑可作為一種藥物載體被DC細(xì)胞有效吞噬攝取，并作為一種外來抗原促進(jìn)DC的成熟分化。但當(dāng)1×105 /ml DC中加入的乳劑劑量超過20μl時(shí)，DC出現(xiàn)