人直腸癌組織勻漿上清對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的內(nèi)皮化影響.pdf

1、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在腫瘤免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。而在體內(nèi)，腫瘤組織通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子營(yíng)造特殊的微環(huán)境來(lái)影響樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，從而逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視。探討腫瘤環(huán)境下樹(shù)突狀細(xì)胞的功能及作用將是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。最近George Coukos等研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)樹(shù)突狀細(xì)胞前體在VEGF-A的影響下，發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞化，參與了腫瘤微

2、血管的形成，從而促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移。 研究目的 本實(shí)驗(yàn)研究直腸癌腫瘤微環(huán)境對(duì)DC的功能和細(xì)胞表型的影響，在體外利用直腸癌勻漿上清液作為人外周血來(lái)源的DC培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化劑，來(lái)觀察DC內(nèi)皮化等表型變化的現(xiàn)象，探討腫瘤血管發(fā)生的新機(jī)制，為腫瘤治療提供一種新的治療靶點(diǎn)和治療思路。 實(shí)驗(yàn)方法 1.免疫組化檢測(cè)腫瘤微血管處S-100蛋白的表達(dá)免疫組化SABC法對(duì)10例直腸癌及癌旁組織切片進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)觀察腫瘤

3、組織微血管壁及微血管旁有無(wú)S-100蛋白的表達(dá)，因S-100蛋白可作為樹(shù)突狀細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記分子，可以間接推測(cè)腫瘤環(huán)境中DCs是否參與了腫瘤微血管的形成。 2．ELIISA檢測(cè)勻漿上清液VEGF-A的含量將腫瘤組織200mg：1ml生理鹽水的比例制成腫瘤組織勻漿，用ELISA方法檢測(cè)癌及癌旁勻漿上清中VEGF-A活性因子含量的差異。 3．直腸癌勻漿上清對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表型的影響從外周血來(lái)源的單核細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞，在D

4、C發(fā)育的早期加入勻漿上清誘導(dǎo)其內(nèi)皮化。樹(shù)突狀細(xì)胞在培養(yǎng)至第7d前，可視為未成熟狀態(tài)。因此設(shè)第3d癌上清加入組，第3d癌旁上清加入組；第7d癌上清加入組，第7d癌旁上清加入組；并設(shè)未加上清的正常培養(yǎng)組作對(duì)照。 4．流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞CD1a/CD31，CDlaJCD34雙陽(yáng)性的表達(dá)FACS Calibar檢測(cè)，Cellquest分析軟件分析檢測(cè)結(jié)果。 5．免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞vWF的表達(dá)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞懸液涂片

5、，觀察內(nèi)皮性標(biāo)記分子vWF的表達(dá)情況。 6．統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x±s表示；兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；兩組以上均數(shù)的比較采用單因素方差分析(ANVOA)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、S-100蛋白的表達(dá)腫瘤微血管旁和血管壁可發(fā)現(xiàn)S-100蛋白的表達(dá)，但數(shù)量較少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2、ELISA檢測(cè)勻漿上清VEGF-A含量癌及癌旁勻漿上清液

6、里活性因子測(cè)定顯示，與癌旁勻漿上清相比，癌上清里活性因子VEGF-A的濃度明顯高于對(duì)照組，兩組之間的差異具有顯著性(P<0.05)。 3、CD31，CD34、CD1a等標(biāo)記分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況未加入腫瘤勻漿上清液的正常培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察第1d、3d、7d、10d、14d時(shí)CD31，CD34，CD1a等標(biāo)記分子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：CD31和CD34隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸下降，CD1a在1-7d過(guò)程中表達(dá)逐漸升高，7-14d

7、過(guò)程中表達(dá)則變化不大。 4、勻漿上清對(duì)DC內(nèi)皮化的誘導(dǎo)效應(yīng)第3d力口入各組間比較顯示：癌上清及癌旁上清組CD1a/CD31、CD1a/CD34雙陽(yáng)性的表達(dá)率均高于正常對(duì)照組，且差異具有顯著性(p<0.05)； 第7d加入各組間比較顯示：癌上清及癌旁上清組的CDla/CD31、CDla/CD34雙陽(yáng)性的表達(dá)率也高于正常對(duì)照組，且差異具有顯著性(p<0.05)； 第3d加入各組CDla/CD31，CDla/CD34雙

8、陽(yáng)性表達(dá)率均高于其相對(duì)應(yīng)的第7d加入的各組，且差異具有顯著性(p<0.05)。 癌上清組CDla/CD31，CDla/CD34雙陽(yáng)性表達(dá)率略高于癌旁上清組相比，但差異不顯著(p>0.05)。 5、培養(yǎng)細(xì)胞vWF的表達(dá)癌上清組和癌旁上清組培養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)vWF內(nèi)皮性標(biāo)記分子，與正常組相比，差異具有顯著性(p<0.05).癌與癌旁上清組相比，差異不顯著(p>0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1、在直腸癌腫瘤微血管壁及血