SMADs基因在小鼠內耳聽覺器官發(fā)育中的信號調控作用.pdf

1、耳聾在人群中有很高的發(fā)病率。近幾年，遺傳性耳聾研究飛速的發(fā)展。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多的耳聾相關基因，這些研究成果使得破解聽覺基因，詮釋聽覺系統(tǒng)的分子機制成為可能。但是，有時由于缺少臨床特性，耳聾遺傳異質性及家系比較小等原因，很難完全鑒別出相關基因。此外，某些相關基因由于缺少合適的家系進行連鎖分析，也使得發(fā)現(xiàn)重要基因很困難。小鼠的內耳結構，發(fā)育及導致聽力損失的病理學改變與人類極為相似。因此，小鼠耳聾相關性基因研究提供了另一種方法來鑒定出可能的

2、耳聾基因座。Smad4、Smad5基因是參與轉化生長因子-β(TGF-β)家族信號下游的細胞質內信號轉導分子，主要介導BMP4的信號。早前的研究證實，TGF-β家族成員在動物體內廣泛參與調節(jié)各胚層的發(fā)育、器官的形成、上皮組織的增生、細胞外基質的合成、免疫反應等多種生物學過程。已研究表明，BMP信號分子家族成員及他們的信號轉導分子在雞、小鼠、斑馬魚和非洲蟾蜍的內耳發(fā)育中均有表達，本課題組發(fā)現(xiàn)Smad4、Smad5基因剔除導致小鼠嚴重聽力障

3、礙，而且內耳聽覺器官包括毛細胞、支持細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)等出現(xiàn)不同程度的損害，表明，Smad4、Smad5基因可能是聽功能相關基因。但是，Smad4、Smad5基因對內耳胚胎具體作用部位、作用時間及作用機制，尚未見報道。因此本研究對小鼠內耳聽覺器官發(fā)育過程進行了動態(tài)觀察，對小鼠內耳聽覺器官發(fā)育形態(tài)進行了觀察，并且初步比較了常用兩種品系小鼠發(fā)育的異同點，通過毛細胞特異性標記物MyosinⅥ進一步觀察毛細胞發(fā)育過程。利用免疫組化方法對BMP4、

4、Smad4、Smad5基因在內耳發(fā)育中可能的信號傳導機制進行了探討。 第一部分：小鼠內耳聽覺器官發(fā)育過程研究 目的:研究國內最常用兩種品系小鼠內耳聽覺器官發(fā)育演變過程，為研究內耳發(fā)育選擇合適品系小鼠提供依據(jù)。 方法：選用耳廓反應靈敏、健康的C57BL/6小鼠和昆明白種小鼠分別作為種鼠交配，用觀察陰栓方法獲得適齡胎鼠，≤18天取胚胎頭，≥19天在顯微鏡下取耳蝸，胚胎頭水平冰凍切片，耳蝸平行于蝸軸冰凍切片，HE染色方

5、法觀察小鼠耳蝸發(fā)育形態(tài)演變過程。應用：Myosin Ⅵ免疫熒光化學方法標記毛細胞。 結果：昆明白種小鼠和C57BL/6小鼠內耳發(fā)育過程基本相似，但昆明白種小鼠的內耳發(fā)育時間比C57BL/6小鼠晚一天。HE染色觀察C57BL/6小鼠，胚胎第10天，聽泡發(fā)育，胚胎12天聽泡下部有蝸管始基形成并開始發(fā)育。胚胎第17天，蝸管基底部外側形成可辨認的毛細胞，耳蝸底轉未來形成Corti隧道的部位變的比較明顯，并且血管紋開始分化。小鼠剛出生時底

6、轉的Corti器形態(tài)已接近成熟，基底膜仍較厚，Corti器隧道尚未形成，血管紋已發(fā)育。出生后第8天，Corti隧道變寬。出生后第10天，Nuel間隙形成，耳蝸形態(tài)發(fā)育基本成熟。MyosinⅥ免疫熒光從胚胎17天開始在毛細胞陽性表達。 結論：內耳聽覺器官發(fā)育具有一定的規(guī)律，昆明白種小鼠和C57BL/6小鼠內耳發(fā)育過程基本相似，但昆明白種小鼠的內耳發(fā)育時間晚一天。近交系小鼠基因型更純合一致，故第二部分實驗動物選擇C57BL/6小鼠。

7、 第二部分 Smad4/Smad5基因在小鼠內耳聽覺器官發(fā)育中的信號調控作用 目的：研究Smad4/Smad5基因在小鼠內耳耳蝸發(fā)育過程中的作用及可能的作用機制以及與BMP4的關系。 方法：選用耳廓反應靈敏、健康的C57BL/6小鼠作為種鼠交配，用觀察陰栓方法獲得胚胎9天到20天的胎鼠，≤18天取胚胎頭，≥19天在顯微鏡下取耳蝸，胚胎頭水平冰凍切片，耳蝸平行于蝸軸冰凍切片，HE染色方法觀察小鼠內耳發(fā)育形態(tài)演變過程

8、，免疫組織化學方法檢測Smad4、Smad5、BMP4基因蛋白在小鼠胚胎第10天到出生后14天的表達情況。 結果：BMP4和Smad5在小鼠內耳聽覺器官的整個發(fā)育過程中均有表達。表達的部位及表達程度基本一致，在聽囊期，表達遍及整個聽囊上皮。內耳聽覺器官胚胎分化及成熟初期表達主要集中在將發(fā)育成感覺細胞及支持細胞的部分；耳蝸胚胎發(fā)育成熟期開始，表達明顯，在內耳耳蝸均有表達，主要表達在內外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、支持細胞、血管紋、基底

9、膜、前庭膜等，骨蝸管及蝸軸的表達最為強烈。到出生時，耳蝸大體結構發(fā)育基本形成，前庭膜、蓋膜、血管紋及基底膜上結構包括毛細胞在內亦均見表達。Smad4的表達在時間上與BMP4和Smad5有所不同，小鼠胚胎期聽泡發(fā)育及耳蝸蝸管增殖期未見陽性表達，胚胎15天開始，空間表達部位與BMP4和Smad5基本相同。Smad5、Smad4和BMP4在內耳聽覺器官胚胎發(fā)育中后期，胚胎14天細胞開始分化以后，在時間、空間的表達基本一致。 結論：BM