LSD1對T細胞及NK細胞表型的影響.pdf

1、目的：
　　1.探討賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）缺失對T細胞及NK細胞譜系發(fā)育的影響。
　　2.探索Vav-Cre介導(dǎo)的黃色熒光蛋白（YFP）報告基因系統(tǒng)標記小鼠體內(nèi)自然殺傷（NK）細胞的特異性和效率。
　　方法：
　　本課題分兩部分進行：
　　第一部分：采用 C57BL/6小鼠胸腺，制成單細胞懸液，通過流式細胞術(shù)分選、qRT-PCR方法檢測LSD1在T細胞DP、SP發(fā)育階段的表達情況；雜交含

2、有LSD1（fl/fl）基因型和Lck-Cre+基因型小鼠，通過基因型分型篩選出 LSD1(fl/fl) Lck-Cre+條件性基因敲除小鼠，采用雜交后代LSD1(wt/wt)Lck-Cre-小鼠(6周)作為對照組（WT），LSD1(fl/fl) Lck-Cre+條件性基因敲除小鼠（6周）作為實驗組（KO），各取其胸腺、脾、淋巴結(jié)組織制成單細胞懸液，通過CD4、CD8、CD44和CD25細胞表面標記流式分析T細胞發(fā)育階段各種細胞百分比的

3、變化以及NKp46、NK1.1細胞表面標記流式分析NK細胞的百分比變化。
　　第二部分：雜交 ROSA26R-YFP和Vav-Cre+轉(zhuǎn)基因鼠，通過基因型分型篩選ROSA26R-YFP與Vav-Cre+小鼠雜交后代中雙陽性基因型小鼠，流式細胞術(shù)分析免疫器官淋巴結(jié)、脾、胸腺以及骨髓細胞的YFP表達效率，通過NK1.1和CD122細胞表面標記篩選出淋巴結(jié)、脾及骨髓的NK細胞，流式細胞術(shù)分析NK細胞群體中YFP陽性細胞百分比。
　

4、　結(jié)果：
　　第一部分：(1)qRT-PCR檢測LSD1在T細胞發(fā)育過程中DP、CD4(SP)、CD8(SP)細胞中的表達量，結(jié)果顯示LSD1皆有顯著表達，而DP、CD4（SP）、CD8(SP)細胞三者之間，DP細胞表達量最高，CD4和CD8細胞表達量無明顯差異，LSD1在DP向SP的T細胞發(fā)育過程中表達量具有逐漸減低的趨勢。(2)通過數(shù)次雜交LSD1（fl/fl）基因型和Lck-Cre+基因型小鼠，結(jié)果共獲得3只LSD1(fl/

5、fl)Lck-Cre+條件性基因敲除小鼠，它們分別來自不同的親代。(3)細胞計數(shù)結(jié)果顯示，LSD1基因敲除小鼠（KO）胸腺T細胞總數(shù)和對照組小鼠(WT)相比減少約10倍（KO2.5±0.8×107 vs WT23.0±7.2×107，P<0.05），淋巴結(jié)T細胞總數(shù)（KO11.0±2.5×107 vs WT13.0±3.7×107，P>0.05）和脾臟T細胞總數(shù)(KO12.1±2.8×107 vs WT15.3±1.3×107，P>0.

6、05)則沒有顯著差異。(4)流式細胞術(shù)分析胸腺T細胞中DP細胞（KO63.5±12.4 vs WT86.2±1.2，P>0.05）、CD4細胞（KO15.3±4.8 vs WT7.9±0.8，P>0.05）、CD8細胞（KO10.7±6.1 vs WT4.5±1.8，P>0.05）的百分比(％)變化沒有顯著差異，淋巴結(jié)T細胞中的CD8細胞百分比(%)（KO13.4±1.0 vs WT28.3±0.6，P<0.05）和對照組相比減少了2.

7、1倍，CD4細胞以及脾臟T細胞中的CD4、CD8均無顯著差異（P>0.05）。(5)流式細胞術(shù)分析LSD1基因敲除小鼠（KO）胸腺 T細胞中的DN1細胞的百分比(%)和對照組相比（KO51.0±11.9vs WT16.7±1.3,P<0.05）增加了約3.1倍，而DN2、DN3、DN4均有不同程減少的趨勢，但沒有明顯差異（P>0.05）。（6）流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，和對照組小鼠(WT)相比，LSD1基因敲除小鼠（KO）胸腺 NK細胞百分比

8、(%)增加了約6倍（KO4.2±1.2vs WT0.6±0.3），淋巴結(jié)中 NK細胞百分比(%)增加了約4倍（KO8.9±1.0vs WT2.2±0.8），脾臟中NK細胞百分比(%)增加了約2.5倍（KO22.0±2.2vs WT8.7±1.3）(均P<0.05)。
　　第二部分：ROSA26R-YFP與Vav-Cre小鼠雜交后代共17只，雙陽性基因型小鼠（ROSA26R-YFP（+/-）Vav-Cre）11只；流式細胞術(shù)分析淋巴

9、結(jié)、脾、胸腺、骨髓細胞中 YFP陽性細胞的百分比（%）分別為73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60±3.56，陰性對照組相應(yīng)器官分別為0.27±0.01、1.33±0.91、0.11±0.01，0.29±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），兩種類型小鼠非免疫器官腎中均無明顯 YFP表達（雙陽性鼠0.72%±0.43%，對照鼠0.92%±0.27%，P>0.05）；淋巴結(jié)、脾和骨髓中 NK細