心律失常調(diào)控相關(guān)的心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子探討.pdf

1、背景與目的：
　　心血管疾病是嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，居各種死因之首；且心血管系統(tǒng)疾病中，心律失常是最為嚴重的病癥之一。研究表明，心律失常與心肌細胞膜上離子通道的突變有關(guān)；但大部分離子通道并未發(fā)生實質(zhì)性病變的臨床病人，仍然發(fā)生了心律失常，可能與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，抑制下游離子通道基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致離子通道表達量減少相關(guān)。雖然轉(zhuǎn)錄因子在心律失常中的作用研究得較多，但心律失常的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且機制尚不清楚

2、。而近年來研究表明GWAS分析可為疾病的調(diào)控機制提供預(yù)測和研究基礎(chǔ)，因此，本研究旨在1.分析心律失常相關(guān)GWAS數(shù)據(jù)，找到心律失常易感基因，特別是心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子；2.通過生物信息學(xué)手段，分析心肌細胞HL-1的ChIP-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合GWAS和增強子信號，尋找轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控心律失常常見基因SCN5A的靶點；；3.重點研究TBX5調(diào)控SCN5A的靶點，闡明這些靶點與目的基因SCN5A表達的相關(guān)性；研究結(jié)果將為心律失常相關(guān)的離子通道蛋白

3、Nav1.5的調(diào)控機制提供新的內(nèi)容，為心律失常相關(guān)基因 SCN5A的調(diào)控提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.結(jié)合心律失常的GWAS數(shù)據(jù)，找到心律失常易感基因，推測基因組調(diào)控區(qū)在心律失常中的作用。
　　2.運用生物信息學(xué)手段分析小鼠心肌細胞HL-1的C hIP-seq數(shù)據(jù)，找到轉(zhuǎn)錄因子TBX3、TBX5、TBX20、NKX2-5、GATA4對SCN5A基因的結(jié)合位點；
　　3.用Luciferase報告基因系統(tǒng)驗證

4、結(jié)合位點的啟動子/增強子活性：設(shè)計TBX5對SCN5A基因結(jié)合位點區(qū)的引物，分別構(gòu)建入pGL3載體中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，進行雙熒光素酶活性測定；
　　4.運用crispr/cas9技術(shù)在結(jié)合位點區(qū)域設(shè)計sgRNA，建立針對小鼠心肌細胞SCN5A基因的阻遏模型，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測阻遏模型對SCN5A基因轉(zhuǎn)錄的影響；
　　結(jié)果：
　　1.小鼠心臟或小鼠心肌細胞HL-1中與心律失常相關(guān)的基因共137個，分別與轉(zhuǎn)

5、錄因子TBX3（72個）、TBX5（112個）、TBX20（50個）、NKX2-5（68個）、GATA4（25個）結(jié)合；受 TBX20調(diào)控的主要心律失常基因有 MYH6、MYH7、PLN、CDKN1A、SCN5A、GOT2、CASQ2、PRKCD、ATP1B1和FADS1；受TBX5調(diào)控的主要心律失?；蛴蠸CN5A、CASQ2、KCNH2、PLN、SCN10A、KCNQ1；
　　2. TBX3、TBX20、GATA4、NKX2-

6、5分別在靶基因SCN5A上有4個、1個、1個、6個結(jié)合位點；TBX5在靶基因SCN5A上有12個結(jié)合位點，其中1個距基因上游9kb左右（c hr9:119498070-119498519），其他11個都位于基因下游（chr9:119378730-119379479，等）；
　　3. SCN5A基因的增強子（pGL3-enhancer）及啟動子（pGL3-promoter）重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建；
　　4. TBX5在靶基因SCN