噬菌體展示肽庫篩選大腸癌早期檢測分子標(biāo)志群.pdf

1、[目的]構(gòu)建噬菌體展示肽庫，篩選出大腸癌早期檢測分子標(biāo)志群，確定臨床可以使用的診斷大腸癌的分子標(biāo)志。
　　 [方法](1)構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫：收集30例上海長海醫(yī)院肛腸外科手術(shù)后立即凍存的大腸癌組織標(biāo)本。用Trizol法抽提總RNA，用mRNA提取試劑盒結(jié)合poly(A)的磁珠提取mRNA，通過OrientExpression cDNA和Cloning System兩個試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、末端平齊、片段長短篩選、加接頭、雙酶

2、切、加雙臂、體外包裝等步驟，成功地構(gòu)建了大腸癌噬菌體展示肽庫。(2)大腸癌特異性的相關(guān)肽的富集：我們進(jìn)行了正反向的五輪親和篩選以富集可以和大腸癌自身抗體相結(jié)合的特異的展示肽。(3)大腸癌特異性標(biāo)志物的篩選：隨機挑選了五輪篩選后的2000個噬菌體克隆進(jìn)行ELISA初篩。96孔酶標(biāo)板用1∶10000稀釋的T7 tailer抗體包被，經(jīng)洗滌、封閉、洗滌、加噬菌體液、加血清、洗滌、加HRP耦聯(lián)的羊抗人IgG、洗滌、顯色、終止等步驟，在波長450

3、m下通過酶標(biāo)儀讀取OD值。大腸癌組為陽性、對照組為陰性的噬菌體即為有意義的、可能具有診斷價值的樣本。(4)測序和蛋白質(zhì)功能預(yù)測：通過ELISA篩選出的噬菌體克隆，測序后經(jīng)過NCBI上的BLAST序列對比找到完全一致的或者最接近的已知基因序列，從而推測我們所獲得的基因與癌癥是否相關(guān)。(5)ELISA復(fù)篩：經(jīng)測序及比對后，共20個克隆用30例大腸癌患者血清及30例對照患者血清進(jìn)行ELISA復(fù)篩。方法同ELISA初篩。(6)ELISA驗證：經(jīng)

4、ELISA復(fù)篩后，挑選出有代表性的5個克隆，用60例大腸癌患者血清及60例對照患者血清進(jìn)行ELISA驗證。方法同ELISA初篩。(7)免疫組化驗證：對COX6B1進(jìn)行免疫組化驗證，采用EnVision二步法進(jìn)行。
　　 [結(jié)果](1)構(gòu)建的大腸癌噬菌體展示肽庫的滴度為3.0×106pfu。隨機挑選20個噬菌體斑進(jìn)行PCR鑒定其重組率為60％。(2)ELISA初篩共篩選出22個有意義的噬菌體克隆，其中871號噬菌體擴增失敗。獲得其

5、它21個克隆測序結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)其中有2個基因測序失敗，5個為未知功能的基因，在已經(jīng)研究過的基因中有報道有11個基因與腫瘤相關(guān)。21個基因中有一組相同基因，分別為73和1048號。(3)ELISA復(fù)篩后挑選出具有代表性的5個克隆，分別為95號、149號、174號、396號及1009號。(4)ELISA驗證可見95號、149號、174號、396號及1009號噬菌體診斷大腸癌的ROC曲線下面積分別為0.763，0.669，0.790，0.742

6、，0.796(所有P＜0.05)。其聯(lián)合檢測大腸癌的敏感度為95％(P＜0.001)，特異度為69％(P＜0.001)，其ROC曲線下面積為0.886，95％可信區(qū)間為(0.827，0.945)。(5)免疫組化結(jié)果顯示COX6B1在大腸癌組織表達(dá)顯著高于正常粘膜組織。經(jīng)統(tǒng)計兩者間有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 [結(jié)論](1)T7噬菌體展示肽庫的構(gòu)建可以很好的展示各種小豐度的蛋白。(2)五輪親和篩選可富集表達(dá)大腸癌特異抗原