幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性及其機理的研究.pdf

1、背景與目的人類幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，簡稱H.pylori或簡寫為Hp)是一種革蘭氏陰性菌，主要存在于胃粘膜的粘液層，被認為是慢性活動性胃炎、萎縮性胃炎、十二指腸球部潰瘍的重要致病因素，是胃癌的高危因素，與粘膜相關的淋巴瘤等疾病關系密切。越來越多的研究發(fā)現H.pylori感染和許多胃腸外疾病，包括心血管疾病、皮膚病等有某種統(tǒng)計學上的關聯，因此，H.pylori感染及其相關疾病已成為重要的公共健康課題。

2、H.pylori對抗生素，特別是對克拉霉素和甲硝唑的原發(fā)耐藥率在普遍上升.對常用根除方案的療效產生了影響。闡明耐藥機制、克服原發(fā)耐藥、避免繼發(fā)耐藥和治療失敗后的補救治療是近年H.pylori治療方面的研究熱點。 關于克拉霉素耐藥機制，1996年Versalovic等首次報道了克拉霉素耐藥性的產生與H.pylori23SrRNA基因的點突變有關，導致核糖體的構象改變，使大環(huán)內酯類抗生素結合位點也隨之發(fā)生改變，進而使H.pylori

3、與大環(huán)內酯類藥親和能力減弱，藥物不能阻止細菌的蛋白合成，最終產生耐藥性。 基因芯片其實質是在玻片、硅片、薄膜等載體上有序地、高密度地固定大量的靶基因片段或寡核苷酸片段，這些被固定的分子探針在基質上就形成了高密度的DNA微陣列。樣品核酸分子經過標記后，與固定在載體上的DNA陣列中的點進行雜交。通過檢測雜交信號而獲得樣品分子的數量和序列信息，從而對基因序列及功能進行大規(guī)模、高密度的研究。由于基因芯片采用了信息的集約化和平行處理原理，

4、具有無可比擬的高效、快速和多參數的特點，是傳統(tǒng)生物技術的一次重大創(chuàng)新和突破?；蛐酒瑧妹婧軓V，如醫(yī)學、軍事、司法及農業(yè)等，具體包括基因表達譜、疾病診斷、藥物篩選、新基因尋找、重測序、基因分型、遺傳作圖和基因突變等多個領域。還可以進行基因功能研究及疾病發(fā)生機制、疾病分型及藥物篩選等多方面研究。 本研究選取胃鏡下胃黏膜活檢標本，體外分離、培養(yǎng)幽門螺桿菌，并行克拉霉素藥敏試驗，初步篩查人群中幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥情況。寡核苷酸微

5、陣列技術與測序檢測H.pylori23SrRNA基因2142、2143和2182位點突變，分析H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性與H.pylori對克拉霉素耐藥的關系，探索H.pylori對克拉霉素耐藥的分子機制，指導臨床用藥。 第一部分人群中幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的調查本實驗收集胃鏡檢查病例，取胃黏膜活檢標本進行H.pylori培養(yǎng)，分離鑒定后行克拉霉素藥敏試驗，初步篩查H.pylori對克拉霉素的耐藥情況，監(jiān)測H.

6、pylori耐藥菌株。 1、材料胃粘膜活檢標本取自普陀人民醫(yī)院、三門人民醫(yī)院、義烏市人民醫(yī)院、鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院，嘉興市第一人民醫(yī)院、溫嶺市第一人民醫(yī)院行胃鏡檢查的病人，胃竇和胃體各取1塊粘膜組織?；颊呓邮芪刚衬せ顧z均簽署知情同意書。 2、實驗方法胃鏡下活檢組織研磨后加入增菌管中，37℃微需氧培養(yǎng)48小時，再用接種環(huán)挑取增菌液在分離培養(yǎng)基上分離，微需氧培養(yǎng)72小時，進行純培養(yǎng)。所得菌株直接顯微鏡檢查后經氧化酶反應試驗法、觸酶試

7、驗、尿素酶試驗鑒定為H.pylori菌株。最后用紙片瓊脂擴散法行抗生素藥物敏感試驗檢測H.pylori對克拉霉素的耐藥性。 3、結果(1)H.pylori菌落形態(tài)：圓形孤立的小菌落，灰白色、半透明呈露滴狀，直徑約0.5～1.5mm，血瓊脂上有輕度溶血。顯微鏡下可見菌體細長彎曲呈螺形、S形或海鷗形，革蘭氏染色陰性。經生化試驗鑒定為H.pylori菌株。 (2)在1439病例中培養(yǎng)陽性率為32.73％。(3)H.pylori

8、培養(yǎng)陽性菌株471株，其中藥敏試驗顯示對克拉霉素耐藥有165株，耐藥率為35.03％。H.pylori對克拉霉素耐藥率無年齡和性別的差異。 第二部分對克拉霉素耐藥幽門螺桿菌23SrRNA基因多態(tài)性的研究本實驗試圖利用基因芯片技術來檢測H.pylori23SrRNA基因的多態(tài)性，探索H.pylori對克拉霉素耐藥的分子機制，明確H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性與H.pylori對克拉霉素耐藥的關系，發(fā)展個性化給藥方案，為初

9、步建立技術檢測平臺提供基礎。 1、材料胃粘膜活檢標本取自浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院消化科行胃鏡檢查的病人。 2、實驗方法胃鏡活檢標本抽提DNA后，利用H.pylori23SrRNA行PCR基因片段擴增，參考文獻設計寡核苷酸探針，用芯片點樣儀點至醛基化玻片上，Cy3-標記的不對稱PCR產物與之雜交，雜交完成后芯片用激光共聚焦掃描儀掃描并分析。采用CEQTMTDCS試劑盒(BECKMANCOULTERTM，USA)，在CEQ

10、TM2000XL測序儀(BECKMANCOULTERTM，USA)上進行測序。 3、結果經病理和PCR證實為H.pylori陽性的54例標本，雜交結果顯示A2142位點均為野生型(54/54)；A2143G突變率為11.11％(6/54)，尚未發(fā)現A2143C和A2143T的突變；C2182T突變率為12.96％(7/54)，尚未發(fā)現C2182A和C2182G的突變，其余均為野生型。 直接測序法驗證：寡核苷酸微陣列技術與

11、測序檢測H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性結果完全一致。 結論1、H.pylori對克拉霉素耐藥率為35.03％。2、H.pylori23SrRNAA2142位點均為野生型(54/54)；A2143G突變率為11.11％(6/54)，尚未發(fā)現A2143C和A2143T的突變；C2182T突變率為12.96％(7/54)，尚未發(fā)現C2182A和C2182G的突變，其余均為野生型。 3、直接測序法驗證寡核苷酸微陣列技術