Toll樣受體2在分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：通過建立體外分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞模型，觀察不同分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化，通過流式細(xì)胞儀和Western blot方法檢測巨噬細(xì)胞Toll樣受體2(TLR2)的含量，研究TLR2在分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中的作用。比較不同分枝桿菌在感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞凋亡及TLR2表達(dá)水平的差異，初步探討分枝桿菌致病機(jī)制上的差異。
　　 方法：體外培養(yǎng)U937細(xì)胞，并用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化使之具有吞噬能

2、力，用胞內(nèi)分枝桿菌(M.in)、結(jié)核分枝桿菌(MTB)、膿腫分枝桿菌(M.ab)分別感染已分化的U937細(xì)胞作為體外細(xì)胞感染模型，于0h、4h、8h、24h、48h、72h提取各組U937細(xì)胞，提取出的標(biāo)本分為兩份，一份標(biāo)本用Annexin V/PI染色并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，另一份分別用流式細(xì)胞儀及Western blot檢測U937細(xì)胞TLR2的表達(dá)量。使用抗TLR2的單克隆抗體阻斷U937細(xì)胞的TLR2，用各種分枝桿菌感染阻

3、斷TLR2后的U937細(xì)胞，觀察U937細(xì)胞感染各種分枝桿菌后凋亡率的變化。
　　 結(jié)果：(1)三種分枝桿菌感染U937細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間的推移逐漸升高，4h的細(xì)胞凋亡率分別為6.00±0.3％(MTB組)、6.36±0.25％(M.in組)、6.63±0.44％(M.ab組)，與正常對照組5.96±0.22％的U937細(xì)胞凋亡率無明顯差別(P均＞0.05)；8h各組分枝桿菌感染的U937細(xì)胞凋亡率差異開始顯現(xiàn)，其中M.i

4、n組10.47±0.65％、M.ab組13.40±1.15％明顯高于正常對照組7.18±0.7％(P＜0.01)，而MTB組7.80±0.53％和正常對照組7.18±0.7％仍無明顯差異(P＞0.05)；至72h時(shí)各組細(xì)胞凋亡率差別進(jìn)一步增大，M.in組18.64±1.41％、M.ab組37.70±1.31％明顯高于對照組11.22±1.07％(P＜0.01)，而MTB感染組12.57±1.18％和對照組仍無差別(P＞0.05)。72h

5、時(shí)各組細(xì)胞的凋亡率由高到低的排列依次為M.ab組、M.in組、MTB組。(2)U937細(xì)胞膜的TLR2表達(dá)量在剛接觸分枝桿菌時(shí)較低，熒光強(qiáng)度分別為MTB組3.25±0.54、M.in組2.82±0.27、M.ab組3.19±0.37，與正常對照組3.23±0.36相比無明顯差異(P＞0.05)；TLR2的表達(dá)量在分枝桿菌感染后4h內(nèi)迅速升高，至4h時(shí)TLR2表達(dá)量為MTB組17.67±2.37、M.in組8.83±0.78、M.ab組6

6、.80±0.72，與陰性對照組3.07±0.33比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各感染組8h后U937細(xì)胞的TLR2表達(dá)量穩(wěn)定下來，不再明顯變化。各種分枝桿菌感染U937細(xì)胞72h后TLR2的表達(dá)量并不相同，其表達(dá)量由高到低排列依次為MTB、M.in、M.ab，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，用Western bolt方法檢測U937細(xì)胞內(nèi)的TLR2的含量得到相似的結(jié)論。(3)用抗TLR2的單克隆抗體阻斷U937細(xì)胞膜表面的

7、TLR2受體，再用三種分枝桿菌感染阻斷TLR2后的U937細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測U937細(xì)胞的凋亡，72h時(shí)凋亡率MTB組為12.37±0.57％、M.in組為13.67±0.56％、M.ab組為17.39±0.98％、正常對照組為11.21±0.66％，與未阻斷TLR2的U937細(xì)胞相比，阻斷TLR2的U937細(xì)胞感染M.in及M.ab后72h的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)，而正常對照組及MTB組則無顯著差異(P＞0.05)。