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文檔簡介
1、目的:Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是病原相關分子模式識別受體,與相應配體結(jié)合后激活其下游信號轉(zhuǎn)導途徑,誘導炎癥反應和天然免疫應答,同時促進抗原提呈細胞的活化并介導獲得性免疫反應,從而在宿主抗微生物感染中發(fā)揮重要作用。TLR3是病毒雙鏈RNA識別受體,活化后能激活NF-κB和IRF3途徑來抵抗病毒感染。此外,TLR3活化后還能誘導細胞損傷,并破壞體內(nèi)血管屏障引起病毒擴散,從而加速疾病的進程。本研究的目
2、的是通過分析TLR3損傷的關鍵信號分子,嘗試抑制此關鍵分子來干預TLR3誘導的細胞損傷,為臨床選擇相關靶點延緩感染性疾病的進程提供理論基礎。 方法:1、RT-PCR檢測基因的表達。2、流式細胞術檢測蛋白質(zhì)的表達。3、Western blot檢測信號轉(zhuǎn)導分子的活化。4、PI/Annexin V染色檢測細胞凋亡水平。5、抗體中和實驗驗證相關信號分子與細胞凋亡的相關性。6、構建真核表達載體pcDNA3.1+/ΔNp63α并轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞
3、,檢測ΔNp63α對TLR3誘導細胞凋亡的影響。 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC較高表達Toll樣受體家族中的TLR2、3、4和5,低表達TLR6和9,不表達TLR1、7、8和10。作為對照人外周血單個核細胞表達所有TLR1-10基因。利用TLR3配體dsRNA的類似物Poly I:C刺激HUVEC,結(jié)果顯示Poly I:C上調(diào)TLR3基因表達并呈劑量依賴性,F(xiàn)ACS分析結(jié)果顯示HUVEC細胞表達TLR3蛋
4、白質(zhì)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Poly I:C作用TLR3誘導了其下游信號分子NF-κB的活化,并劑量依賴性地上調(diào)細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β的基因表達,表明HUVEC表達功能性的TLR3受體。此外,Poly I:C處理的HUVEC細胞表現(xiàn)出與Staurosprine(一種凋亡誘導化學物質(zhì))處理后相似的形態(tài)學改變,PI/Annexin V染色顯示Poly I:C誘導了劑量相關的細胞凋亡;這種作用
5、由TLR3所介導,因為TLR3的中和抗體能顯著抑制Poly I:C所誘導的細胞凋亡。Poly I:C處理的HUVEC同時活化了caspase8和9及其下游分子PARP,caspase和PARP抑制劑能顯著抑制Poly I:C誘導的凋亡,表明TLR3通過內(nèi)源性途徑(又稱線粒體途徑)和外源性途徑(又稱死亡受體途徑)誘導細胞凋亡。由于我們同期的研究還發(fā)現(xiàn)TLR3誘導的細胞凋亡受p53家族成員TAp63α的調(diào)控,因此我們構建了TAp63α的顯性
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