miR-148a在骨肉瘤患者體內(nèi)的表達及其功能機制的研究.pdf

1、背景：骨肉瘤生長快增殖迅速，生長方式呈浸潤性生長破壞周圍正常組織。骨肉瘤惡性程度高而且進展快，早期即易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移且易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。目前尚無有效的治療手段將之完全治愈。因此，該疾病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。對于骨肉瘤的研究，人們已經(jīng)在分子水平取得了長足的進步，找到了一些骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，其中就包括對與骨肉瘤相關(guān)的miRNA的研究。microRNA是19-25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，它與靶基因mRNA的

2、3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)通過堿基序列互補特異性結(jié)合，進而抑制靶基因蛋白質(zhì)翻譯?，F(xiàn)已在人體細胞中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種miRNA，廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等過程的基因表達調(diào)控，并與包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前在骨肉瘤中已篩選出一些表達異常miRNAs。其中，在骨肉瘤中miR-34家族成員表達降低，而miR-34家族可通過一種p53依賴方式影響靶基因的表達。miR-34c通過抑制Notch信號途徑抑制成骨細胞分化，促進骨肉

3、瘤發(fā)生。在骨肉瘤中miR-24過表達，通過調(diào)節(jié)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶β(lysophosphatidicacid acyltransferaseβ，LPAATβ)基因表達參與骨肉瘤發(fā)病。miR-16可以抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶(Raf1-mitogen-activated protein kinase，MAPK)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路，沉默胰島素樣

4、生長因子-1受體(Insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R)，抑制細胞生長。在骨肉瘤中，miR-16表達下調(diào)。miR-148a是miR-148/152家族成員之一，已有研究顯示，miR-148a在腫瘤細胞增殖和癌癥侵襲過程中起著重要的作用，并且在不同的腫瘤組織中表達具有特異性。有研究采用高通量的microRNA表達譜芯片的方法研究骨肉瘤組織中異常的microRNA表達譜，結(jié)果顯示，骨肉瘤組織

5、中存在有數(shù)十個顯著表達差異的microRNA，其中包括miR-148a。本研究的前期實驗也表明:miR-148a在骨肉瘤中的表達較癌旁非腫瘤骨組織的表達明顯上調(diào)，并且在轉(zhuǎn)移組中的表達明顯高于非轉(zhuǎn)移組。由此說明，miR-148a可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展特別是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，但其可能的生物學(xué)功能和機制尚不完全明確。miRNAs不僅在實體腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而且可被釋放入血成為腫瘤特定的標(biāo)記物。在胃癌患者血清中，有許多m

6、iRNAs出現(xiàn)表達水平的上調(diào)或下調(diào)，其中，miR-184表達水平最高，而對胃癌患者進行手術(shù)治療后，miR-184表達水平即明顯下降。在前列腺癌患者外周血中，miR-141表達明顯升高，可用于篩查前列腺癌患者和正常對照組。而miR-148a是否在骨肉瘤患者的外周血中表達異常還尚不明了，其是否能夠成為外周血中的骨肉瘤標(biāo)記物值得探討。
　　目的：探討miR-148a與骨肉瘤的關(guān)系，揭示miR-148a在骨肉瘤中的表達與骨肉瘤臨床病理參數(shù)

7、之間的關(guān)系，為深入了解miR-148a與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù);分析骨肉瘤患者外周血中miR-148a的表達與患者臨床病理資料之間的關(guān)系，為miR-148a作為骨肉瘤的外周血標(biāo)記物提供實驗基礎(chǔ);證實miR-148a在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，明確miR-148a是否對骨肉瘤的轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用并篩選miR-148a調(diào)節(jié)的靶基因，為骨肉瘤的治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：⑴在骨肉瘤組織中以RT-qPCR的方法檢測miR-148

8、a的表達情況，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。征求骨肉瘤患者同意，收集骨肉瘤及非腫瘤骨組織的手術(shù)后的石蠟標(biāo)本。經(jīng)病理診斷為骨肉瘤并且完好保存的標(biāo)本經(jīng)切片、脫蠟并準(zhǔn)確刮取骨肉瘤癌組織部分，加入提取試劑按照說明操作將組織中的miRNAs抽提。經(jīng)過分光光度儀測定RNA的濃度和純度以后保存待用。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)RT-qPCR檢測miR-148a表達的情況。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析miR-148a與臨床病理參數(shù)的之間的關(guān)系。相應(yīng)的臨床病理參數(shù)包括性別

9、，年齡，腫瘤大小，腫瘤分期，組織學(xué)類型，腫瘤定位，轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)生存分析和單/多因素分析。⑵檢測骨肉瘤患者血清中miR-148a的表達，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。征求上述骨肉瘤患者同意，在收集骨肉瘤組織標(biāo)本的同時抽取患者外周血5ml，12000轉(zhuǎn)/分高速離心，將分離后分離的血清儲存于-80℃保存待用。抽取健康人志愿者外周血按上述方法處理保存，作為對照樣本。將血清中加入Trizol試劑，按照說明操作提取血清中RNA。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)

10、RT-qPCR檢測血清中miR-148a表達的情況。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)分析miR-148a與臨床病理參數(shù)的之間的關(guān)系。相應(yīng)的臨床病理參數(shù)同骨肉瘤組織中分析miR-148a表達模式的參數(shù)，揭示其在外周血中腫瘤標(biāo)記物的功能。⑶在體外驗證miR-148a對骨肉瘤細胞侵襲能力的影響。將骨肉瘤細胞種植于12孔板中，貼壁后轉(zhuǎn)染miR-148a前體pre-miR-148a及對照片段Negativecontrol;轉(zhuǎn)染后24、48及72小時候收集轉(zhuǎn)染的細胞對

11、miR-148a的轉(zhuǎn)染效率進行檢測。證實能夠成功過表達miR-148a后，將細胞于轉(zhuǎn)染后24小時進行Transwell實驗，在體外細胞學(xué)水平證實miR-148a對骨肉瘤細胞遷移和浸潤能力的影響;同時進行MTS實驗在24，48和72小時檢測miR-148a對細胞增殖能力的影響。⑷驗證miR-148a調(diào)控的直接靶基因。構(gòu)建SMAD2和CHD1的3'-UTR雙熒光素酶載體建。將骨肉瘤細胞種植與12孔板中，貼壁后分別共轉(zhuǎn)染pre-miR-148

12、a+雙熒光素酶載體及pre-miR-NC+雙熒光素酶載體;48小時后收取細胞裂解液檢測實驗組和對照組雙熒光素酶表達差異，鑒別受miR-148a直接調(diào)控的靶基因。
　　結(jié)果：①miR-148a在骨肉瘤組織中的表達及與臨床病理資料的關(guān)系。將收集的標(biāo)本經(jīng)過處理之后，RT-qPCR方法檢測miR-148a在106例骨肉瘤組織及89例非腫瘤組織中的表達，在經(jīng)過統(tǒng)計軟件的對其與臨床病理參數(shù)經(jīng)行分析，結(jié)果顯示相對于非腫瘤骨組織miR-148a在

13、腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯高表達，并且miR-148a在40例發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織樣本中的表達明顯高于56例非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤組織中的表達;miR-148a在≥20歲年齡組患者的骨肉瘤標(biāo)本中明顯高表達。而miR-148a在性別，腫瘤大小，腫瘤定位，組織學(xué)類型及對化療反應(yīng)的不同樣本中表達無明顯差異;相對于存活的患者，miR-148a在已經(jīng)死亡的患者中表達上調(diào)，生存分析顯示miR-148a高表達的骨肉瘤患者具有更短的總體生存時間和腫瘤特異性生存時間;多

14、因素分析顯示miR-148a的表達高低以及轉(zhuǎn)移與否是骨肉瘤患者總體生存和腫瘤特異性生存的獨立預(yù)后因素，腫瘤大小還在總體生存的單因素分析和多因素分析中具有統(tǒng)計學(xué)意義。②miR-148a在骨肉瘤患者外周血中的表達及與臨床病理資料的關(guān)系。RT-qPCR檢測分析顯示miR-148a在骨肉瘤患者的外周血中的表達較健康人外周血中的表達明顯升高，miR-148a還在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的外周血中的表達進一步升高。分析還發(fā)現(xiàn)相對于對化療反應(yīng)差的病例，miR

15、-148a還在對化療反應(yīng)較好的患者外周血中的表達明顯上調(diào)。miR-148a在死亡組的患者外周血中的表達明顯增加，生存分析證實外周血中的miR-148a高表達患者同樣有著較差的總體生存和腫瘤特異性生存預(yù)后。外周血中miR-148a的表達高低是總體生存和腫瘤特異性生存的獨立預(yù)后因素。③miR-148a在骨肉瘤組織和對應(yīng)的外周血中的表達成正相關(guān)。將RT-qPCR檢測miR-148a在106例骨肉瘤組織中的表達和其在對應(yīng)的外周血中的表達做相關(guān)分

16、析，結(jié)果揭示兩者的表達呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。④miR-148a促進骨肉瘤細胞的遷移和浸潤能力。將miR-148a轉(zhuǎn)染進入骨肉瘤細胞系U-2OS，檢測發(fā)現(xiàn)該方法能夠成功實現(xiàn)對miR-148a的過表達。Transwell遷移實驗和浸潤實驗證實過表達miR-148a的骨肉瘤細胞穿過小室的能力均明顯增加，說明miR-148a能夠明顯促進骨肉瘤細胞的遷移和浸潤能力。MTS實驗證實miR-148a對骨肉瘤細胞的增殖能力無明顯影響。（五）miR-148

17、a直接調(diào)控靶基因SMAD2。軟件預(yù)測出miR-148a可能的靶基因SMAD2、CHD1、MED12L及ZNF217，經(jīng)過雙熒光素酶驗證SMAD2受miR-148a的直接調(diào)控。
　　結(jié)論：研究證實了miR-148a在骨肉瘤組織和患者外周血中的表達上調(diào)，并均在轉(zhuǎn)移組中的表達進一步上升;高表達的miR-148a骨肉瘤患者有著較差的5年生存預(yù)后，同時在骨肉瘤與外周血中高表達的miR-148a和遠處轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者的兩個獨立預(yù)后因素;miR