斑點叉尾鮰干擾素α基因的克隆和原核表達及生物活性初探.pdf

1、本試驗根據(jù)Genbank上已發(fā)表的斑點叉尾鮰干擾素(IFN-α)基因序列(AY267538)設計并合成了特異性引物，取新鮮斑點叉尾鮰外周淋巴血并分離淋巴細胞，以草魚出血病病毒(GCHV)誘導后的淋巴細胞提取其總RNA為模板，用RT-PCR.方法擴增出492bp的目的片段，將其克隆到pMDl8-T載體上，經(jīng)酶切鑒定和序列測定證明該序列是斑點叉尾鲴IFN-α。斑點叉尾鮰IFN-α開放閱讀框由492個核苷酸組成，推測其編碼產(chǎn)物由164個氨基酸

2、組成。經(jīng)核酸序列分析比對后發(fā)現(xiàn)，斑點叉尾鲴IFN-α與Genbank已發(fā)表的鯰魚干擾素(IFN-α)序列的同源性較高，為96.5％，氨基酸的同源性為92.6％。在NCBI上的登錄號為EU783919。 將克隆的斑點叉尾鮰IFN-α的成熟肽基因亞克隆到原核表達載體pET-32(a)+的EcoRⅠ、XhoⅠ位點上，構建重組表達載體pET-32(a)+CC-IFN-α。將酶切鑒定正確的重組質粒轉化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，通過不同

3、溫度、時間誘導表達重組IFN-α蛋白。SDS-PAGE和WesternBlotting分析表明，在相對分子質量約為39kD(融合蛋白)處有明顯的蛋白質表達條帶，在30℃、5h表達產(chǎn)物最高，表達的融合蛋白約占菌體總蛋白的48.4％左右，而未經(jīng)誘導的pET-32(a)+CC-IFN-α在39kD處無條帶產(chǎn)生。洗滌表達的IFN-α包涵體并用細胞病變抑制法檢測其抗病毒活性法，通過實驗表明所獲得的重組斑點叉尾鮰IFN-α具有抗病毒反應活性，具有一