斑點叉尾鮰呼腸孤病毒誘導斑點叉尾鮰腎臟組織細胞凋亡的研究.pdf

1、湖北某斑點叉尾鮰苗種場暴發(fā)斑點叉尾鮰出血病，患病魚癥狀為鰭條基部、下頜、鰓蓋、眼眶周圍出血，眼球突出，腹部膨脹。肝、腎失血，脾臟腫大，呈黑紅色。肌肉組織有出血瘀點。該病主要危害體長6-14cm的斑點叉尾鮰魚種，死亡率高達60％以上，造成嚴重經(jīng)濟損失。斑點叉尾鮰出血病的病原為斑點叉尾鮰呼腸孤病毒，屬水生呼腸孤病毒屬成員。
　　 本研究建立了斑點叉尾鮰呼腸孤病毒的培養(yǎng)方法，該病毒可感染斑點叉尾鮰腎臟細胞系并穩(wěn)定傳代，病毒滴度較高為1

2、0-8.67/ml。通過病毒滴度測定，證明反復凍融對病毒滴度無明顯影響（P＞0.05）。
　　 本研究查明了斑點叉尾鮰呼腸孤病毒(CCRV)感染斑點叉尾鮰腎臟細胞(CCK)誘導其發(fā)生凋亡的機理。以CCRV感染的CCK細胞為實驗材料，采用Hoechst33258染色、DNA片段化檢測、TUNEL反應(yīng)、亞G1期細胞檢測以及線粒體膜電位變化檢測等方法進行實驗。感染試驗結(jié)果顯示，病毒感染斑點叉尾鮰腎臟組織細胞后，細胞變圓、皺縮、折光度增

3、加，隨后細胞脫落，細胞單層呈網(wǎng)狀，感染72 h后出現(xiàn)典型細胞病變效應(yīng)(CPE);病毒感染72h后Hoechst33258染色結(jié)果顯示，細胞的染色質(zhì)固縮、核邊緣化或破裂，可觀察到凋亡小體，細胞凋亡率隨時間增加;DNA片段化檢測結(jié)果顯示，病毒感染細胞12 h后細胞基因組DNA出現(xiàn)片段化，隨后逐漸增強，72 h達到最高;TUNEL反應(yīng)結(jié)果表明，病毒感染細胞72 h后細胞基因組DNA斷裂，有大量游離3'末端自由羥基（-OH）存在。亞G1期細胞檢