MicroRNA-2010對CD4+T細(xì)胞活化的調(diào)控及其在尋常型銀屑病發(fā)病中的作用.pdf

1、目的:尋常型銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為特征，因影響外觀，給患者造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)。尋常型銀屑病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，特別是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能缺陷，在尋常型銀屑病發(fā)病中起重要作用。越來越多的研究表明microRNAs通過調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)在CD4+T細(xì)胞的異常活化中起著十分重要的作用。我們課題組之前利用AffymetrixmicroR

2、NA基因芯片技術(shù)比較了9例尋常型銀屑病患者及9例健康對照外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中microRNAs表達(dá)水平的差異并通過RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)microRNA-210(miR-210)在尋常型銀屑病患者PBMCs中表達(dá)明顯升高。本課題進(jìn)一步探索了miR-210在尋常型銀屑病免疫失調(diào)中的作用及機(jī)制，為揭示該病的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　方法:收集18例尋常型銀屑病病人及18例正常對照的健康人外周血，利用密度梯度離心法分離

3、PBMCs，免疫磁珠法分離CD4+T細(xì)胞。利用實(shí)時熒光定量PCR(realtime PCR)檢測miR-210表達(dá)水平;利用Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測miR-210的潛在靶基因;選擇可能與尋常型銀屑病發(fā)病相關(guān)的靶基因，進(jìn)而利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證兩者之間的調(diào)控關(guān)系;利用realtimePCR檢測CD4+T細(xì)胞中miR-210潛在靶基因mRNA的表達(dá)水平，同時利用Western blo

4、t檢測其蛋白水平;利用T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-210 mimic或inhibitor及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染正常人及尋常型銀屑病病人CD4+T細(xì)胞;利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　結(jié)果:與正常對照相比，miR-210在尋常型銀屑病人CD4+T細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高;Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示轉(zhuǎn)錄因子FOXP3是miR-210的潛在靶基因之一，

5、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)FOXP3為miR-210的靶基因;在尋常型銀屑病人CD4+T細(xì)胞中FOXP3表達(dá)水平明顯降低，與miR-210的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。在正常人CD4+T細(xì)胞中過表達(dá)miR-210時，與對照組相比，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)水平明顯下降，同時細(xì)胞因子IL-10、TGF-β表達(dá)水平亦明顯降低，而IFN-γ表達(dá)水平明顯升高;相反，在尋常型銀屑病外周血CD4+T細(xì)胞中的特異性抑制miR-210表達(dá)時，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)水平明顯