血小板活化及其對(duì)單核細(xì)胞亞群調(diào)控在RA發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明，先天和后天多種因素導(dǎo)致的慢性炎性自身免疫疾病。以累及周身關(guān)節(jié)的局部損傷、滑膜炎為主要特征，目前還無(wú)法根治。多種炎性細(xì)胞及促炎因子參與該病的發(fā)生和發(fā)展，越來(lái)越多的研究顯示，血小板除了作為傳統(tǒng)意義上的止血衛(wèi)士外，血小板異?；罨谘装Y和免疫應(yīng)答過(guò)程中也起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。既往國(guó)內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn) RA發(fā)病中有血小板過(guò)度活化表現(xiàn)，但是,獨(dú)立的血小板勢(shì)

2、單力薄，很難發(fā)揮強(qiáng)大的致炎功能，但是在與白細(xì)胞結(jié)合后,二者發(fā)生粘附聚集，導(dǎo)致表面以及內(nèi)部的多種分子被激活并發(fā)生構(gòu)象改變，由此循環(huán)往復(fù)產(chǎn)生的炎癥效應(yīng)被放大，并且互相影響互相活化。
　　單核細(xì)胞作為機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞群，集吞噬、抗原提呈、分泌細(xì)胞因子等功能于一身，是其它類(lèi)型細(xì)胞所不能比擬的。正因?yàn)槿绱?，單核?xì)胞影響著免疫和炎癥反應(yīng)的各個(gè)方面，同時(shí)在許多疾病的病原學(xué)及發(fā)病機(jī)制，特別是在RA發(fā)病中，起著重要的作用。最近，國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)

3、盟命名委員會(huì)將單核細(xì)胞分為CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++三個(gè)亞群，新命名分類(lèi)的這三群細(xì)胞在RA體內(nèi)的分布情況以及活化的血小板與單核細(xì)胞的黏附、聚集對(duì)單核細(xì)胞亞群的分化是否存在影響尚不十分清楚。因此，本課題測(cè)定了RA患者外周血血小板的活化及其與單核細(xì)胞的聚集情況，單核細(xì)胞亞群的比例和分布以及血小板對(duì)單核細(xì)胞活化和表型調(diào)控的作用。深入研究血小板在風(fēng)濕免疫性疾病發(fā)病中的作用，探索該類(lèi)疾病早期診斷及預(yù)后的

4、新指標(biāo)，為臨床治療提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血小板的活化以及CD147的表達(dá)
　　收集本院住院RA患者（均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年RA分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)）外周靜脈抗凝血，將40例RA患者分為30例活動(dòng)組及10例非活動(dòng)組，另設(shè)10例健康對(duì)照分別以Percp標(biāo)記的抗CD61單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗PAC-1、抗 CD147單克隆抗體，PE標(biāo)記的抗 CD40L、CD62P單克隆抗體，采用

5、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RA患者及健康人的血小板表面 CD61設(shè)門(mén)、PAC-1、CD62P、CD40L和CD147表達(dá)的陽(yáng)性率，分析類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血小板表面PAC-1、CD62P、CD40L和CD147的表達(dá)陽(yáng)性率與炎癥活動(dòng)指標(biāo)的相關(guān)性。
　　2. RA外周血中單核細(xì)胞亞群的比例、CD147分子和胞內(nèi)因子的表達(dá)
　　采用PE標(biāo)記的抗CD14抗體、PE-cy5標(biāo)記的CD16抗體、APC標(biāo)記的CCR2抗體染色，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) RA患

6、者外周血單核細(xì)胞亞群分布的比例，觀(guān)察單核細(xì)胞（Mon）3個(gè)亞群：CD14+CD16-CCR2+(Mon1)，CD14+CD16+CCR2+(Mon2)和CD14+CD16+CCR2-(Mon3)的比例以、膜表面CD147分子的表達(dá)和各個(gè)亞群細(xì)胞內(nèi)TNF-a和IL-6的表達(dá)。
　　3.血小板與單核細(xì)胞在RA外周血中的聚集情況
　　采用四種流式表面抗體PE標(biāo)記的抗CD14抗體、PE-cy5標(biāo)記的抗CD16抗體、APC標(biāo)記的抗CC

7、R2抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD42a抗體對(duì)外周血進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA患者外周血血小板與單核細(xì)胞的聚集（MPA：CD14+CD42a+）；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) RA患者血小板與單核細(xì)胞三個(gè)亞群的聚集（CD14+CD16-CCR2+CD42a+，CD14+CD16+CCR2+CD42+和CD14+CD16+CCR2- CD42a+）。
　　4.活化血小板對(duì)單核細(xì)胞亞群的作用
　　分離健康人外周血單核細(xì)胞以及 RA患者的

8、血小板進(jìn)行分組共培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)表面及胞內(nèi)因子染色以及明膠酶譜法觀(guān)察活化血小板對(duì)單核細(xì)胞亞群的比例、增殖、胞內(nèi)促炎因子的分泌變化和MMP的表達(dá)；其次，通過(guò)檢測(cè)單核細(xì)胞不同亞群Ikkβ的表達(dá)以及使用CD147mAb、Ikk抑制劑阻斷血小板與單核細(xì)胞的作用觀(guān)察 CD147是否參與其中，同時(shí)血小板與單核細(xì)胞間的相互作用是否可以通過(guò)阻斷CD147對(duì)NF-κB信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)。
　　分離健康人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）并用流式細(xì)

9、胞儀分選 CD14+的單核細(xì)胞。分離活動(dòng)期RA患者外周血中的洗滌血小板。將分選后的單核細(xì)胞與RA患者的血小板進(jìn)行分組共培養(yǎng)48小時(shí)后，以FITC標(biāo)記的抗TNF-α、IL-6、Ikkβ抗體采用細(xì)胞膜表面標(biāo)志及胞內(nèi)因子四重染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活化血小板對(duì)單核細(xì)胞亞群的比例、增殖和胞內(nèi)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，并采用明膠酶譜法觀(guān)察促進(jìn)MMP的產(chǎn)生的作用。其次，使用抗CD147mAb、Ikk抑制劑進(jìn)行阻斷試驗(yàn)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體阻斷后活化血小

10、板對(duì)單核細(xì)胞亞群的作用。進(jìn)而明確CD147是否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與上述活化血小板對(duì)單核細(xì)胞的作用。
　　結(jié)果：
　　1．類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血小板的活化以及CD147的表達(dá)
　　RA患者外周血血小板表面的標(biāo)記（PAC-1，CD62P，CD40L和CD147）均較健康對(duì)照組明顯升高(Active or Inactive RA,P<0.01)，特別是在活動(dòng)的RA患者組升高尤為明顯(Active RA vs HD,P<0.

11、01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而這四種標(biāo)記中又以CD147的表達(dá)水平增高最為顯著。用DAS-28評(píng)分衡量患者病情活動(dòng)度，并與血小板表面活化標(biāo)記（PAC-1，CD62P和CD147）進(jìn)行相關(guān)性分析顯示呈顯著的正相關(guān)（r=0.497，r=0.57和r=0.63；P<0.01）。研究揭示，RA患者外周血中血小板處于高度活化狀態(tài)并高表達(dá)CD147分子，而且血小板活化和表達(dá)CD147的程度與疾病的活動(dòng)度呈正相關(guān)。2．RA單核細(xì)胞亞群的比例、CD147分

12、子和胞內(nèi)因子的表達(dá)
　　RA患者外周血中Mon1亞群的比例較對(duì)照組降低（Active or Inactive RA vs HD，P<0.01），Mon2、Mon3亞群的比例較對(duì)照組均增高（Active or Inactive RA vs HD，P<0.05），其中尤以Mon2亞群升高的比例最為顯著(Active or Inactive RA vs HD，P<0.001)，而且在這三組對(duì)象中，活動(dòng)的RA患者外周血Mon2亞群的比例較

13、對(duì)照組升高最為明顯（Active RA vs HD,P<0.001）。CD147在RA患者外周血單核細(xì)胞的三個(gè)亞群中均高表達(dá)（Active or Inactive RA vs HD,P<0.01），且以活動(dòng)RA患者外周血Mon2亞群上CD147表達(dá)水平升高最為顯著（Active RA vs HD,P<0.001），同時(shí)該群細(xì)胞表達(dá)TNF-a和IL-6的水平也顯著升高（Active RA vs HD,P<0.001）。研究揭示，RA患者外

14、周血中單核細(xì)胞Mon2亞群比例的升高，CD147和細(xì)胞因子的高表達(dá)提示Mon2亞群具有較強(qiáng)的遷移、侵襲和促炎功能，由此可能在RA的發(fā)病過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)作用。
　　3．RA外周血中血小板與單核細(xì)胞的聚集（MPA）情況
　　MPA的水平在RA患者外周血中顯著升高（Active or Inactive RA vs HD，P<0.001），尤其是在活動(dòng)RA組尤為明顯（Active RA vs HD,P<0.001）。進(jìn)一步分析血小板與

15、單核細(xì)胞各個(gè)亞群的聚集發(fā)現(xiàn)，MPA水平在各個(gè)亞群都有所升高（Active or Inactive RA vs HD,P<0.001），特別是在活動(dòng)期的RA患者組（Active RA vs HD，P<0.001），這其中又以Mon2群升高更為明顯?；顒?dòng)期RA患者外周血中MPA水平與血小板上CD147的表達(dá)、Mon2亞群比例和Mon2亞群上CD147的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示呈顯著的正相關(guān)（r=0.61，r=0.66和r=0.77；），而在與

16、健康對(duì)照以及其他兩個(gè)亞群的相關(guān)性分析中并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究表明，RA患者外周血中血小板與單核細(xì)胞的聚集增多主要是源自于血小板與單核細(xì)胞 Mon2亞群的聚集增加所致，并由此推測(cè) RA患者外周血血小板上高表達(dá)的 CD147和Mon2亞群上高表達(dá)的CD147通過(guò)同型配體之間的相互作用在二者的聚集以及血小板對(duì)單核細(xì)胞亞群的作用中發(fā)揮重要的作用。
　　4．活化血小板對(duì)單核細(xì)胞亞群的作用
　　RA患者的血小板與單核細(xì)胞接觸共培養(yǎng)組Mo

17、n2亞群的比例明顯高于其他分組（P<0.01）。其次，CD147單抗阻斷組和非接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的比例較共培養(yǎng)組低（P<0.01）。此外，我們用BrdU流式試劑盒檢測(cè)了以上分組中單核細(xì)胞亞群BrdU的水平，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的BrdU表達(dá)較其他組升高（P<0.05），說(shuō)明這群細(xì)胞的增殖力旺盛。同樣的分組，我們檢測(cè)單核細(xì)胞各個(gè)亞群胞內(nèi)因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA的血小板與單核細(xì)胞接觸共培養(yǎng)組胞內(nèi)IL-6和TNF-α的水平明

18、顯高于其他分組（P<0.01）。而且，胞內(nèi)因子IL-6和TNF-α的水平主要在Mon2群細(xì)胞表達(dá)升高明顯，在另外兩群中表達(dá)較低尤其是對(duì) Mon1群細(xì)胞的表達(dá)幾乎無(wú)影響。通此外，通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)Ikkβ的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的表達(dá)水平最高（P<0.01），明膠酶譜實(shí)驗(yàn)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。應(yīng)用CD147mAb和Ikk阻斷二者的相互作用發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞 Mon2亞群的比例、增殖能力、與血小板的聚集、胞內(nèi)因子的分泌以及 MMP-9的表達(dá)

19、均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。通過(guò)我們的研究結(jié)果說(shuō)明CD147分子參與血小板促進(jìn)單核細(xì)胞亞群的分化、增殖、侵襲以及發(fā)揮促炎作用，并且該作用是通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　本課題研究結(jié)果顯示RA患者外周血的血小板呈活化狀態(tài)，可高表達(dá)CD147分子，并且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)性；RA患者外周血中的三個(gè)單核細(xì)胞亞群以Mon2亞群比例升高為主，且高表達(dá)CD147分子；血小板三個(gè)單核細(xì)胞亞群中血小板與單核細(xì)胞形成的聚集

20、物水平在RA中顯著增多，且該聚集水平與血小板的活化、Mon2亞群的比例以及高表達(dá)的 CD147均呈正相關(guān)關(guān)系；RA患者外周血的血小板與單核細(xì)胞通過(guò)直接接觸作用影響單核細(xì)胞亞群，尤其是 Mon2亞群的分布比例、增殖，胞內(nèi)因子的分泌和MMP的表達(dá)，并且阻斷CD147分子對(duì)上述效應(yīng)均有顯著抑制作用，說(shuō)明活化血小板上高表達(dá)的CD147對(duì)單核細(xì)胞亞群尤其是發(fā)揮促炎作用的Mon2群的分化中發(fā)揮了重要作用，其次，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ikkβ表達(dá)的分析以及阻斷