黃瓜花葉病毒M株系引致煙草癥狀恢復(fù)的初步研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒M株系在白肋煙上具有典型的癥狀恢復(fù)現(xiàn)象，本研究用提純病毒和DAS-ELISA建立了CMV-M病毒定量檢測方法。研究發(fā)現(xiàn)，癥狀嚴(yán)重程度與葉片中的病毒濃度呈正相關(guān)：最早發(fā)病的黃化葉每克病組織中病毒可高達(dá)790 μ g，而恢復(fù)葉片上部再發(fā)病的花葉癥狀病葉中每克病組織中病毒也可高達(dá)508 μ g，恢復(fù)葉片中病毒含量很低，每克葉片中最高也沒有超過6 μ g，僅為發(fā)病葉片病毒濃度的l/85-1/135，也遠(yuǎn)低于根和莖中的病毒濃度。RT-

2、PCR和生物學(xué)檢測結(jié)果表明恢復(fù)葉片中確實(shí)存在具侵染活性的病毒，但在長達(dá)半個月以上時(shí)間內(nèi)病毒一直保持很低濃度。結(jié)果表明恢復(fù)葉中可能存在有效的病毒防御機(jī)制，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。 煙草的癥狀恢復(fù)與與病毒不同株系遺傳變異直接相關(guān)，測定M-CMV序列有較大的意義。黃瓜花葉病毒RNA2編碼的兩個蛋白RdRp，2b蛋白。2a基因編碼產(chǎn)生RdRp，在RISC中是一重要物質(zhì)，2b基因編碼的2b蛋白是基因沉默的抑制子.本研究測定了RNA2部分

3、序列而得到全序列，發(fā)現(xiàn)RNA2的核酸序列以及蛋白與亞組I其他株系的同源性極高。其核酸與Fny株系的同源性達(dá)98％，與Y株系的同源性達(dá)98％，2a氨基酸與Fny株系的同源性達(dá)97％，與Y株系的同源性達(dá)98％，比較2b氨基酸與Fny株系2b的同源性達(dá)97％，與Y株系2b的同源性達(dá)100％。說明癥狀恢復(fù)的原因不僅在病毒，煙草也扮演了很重要的角色. 正因?yàn)檫@兩個基因重要，少不了對其進(jìn)行大量的研究，需要獲得這兩個基因。本研究成功的將RNA

4、2的ORF分為1200bp，1360bp，333bp三段并克隆到pMDl8-T Vector上，并分別將這些質(zhì)粒命名為P2b-T，P2a.3-T，P2a.5-T，酶切鑒定表明已經(jīng)正確插入，并用P2b—T制備探針，為了進(jìn)一步研究植株中是否有源自RNA2的siRNA，分布，量的多少及在RNA2上的定位打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步把該兩基因克隆進(jìn)GFP打下基礎(chǔ)，進(jìn)而研究煙草癥狀的恢復(fù)與RNA沉默的關(guān)系。 為探明2a基因在不同葉片中的時(shí)空表

5、達(dá)，及其在恢復(fù)機(jī)制中的作用，需要采用血清學(xué)分析技術(shù)，制備特異性抗血清是關(guān)鍵。該基因編碼的蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白，不能夠通過提純病毒制備，本研究在比較原核表達(dá)和酵母表達(dá)的利弊后，將2a基因分段構(gòu)建到pET-30a(+)上，并分別命名為P2a.3-30a，P2a.5-30a，在大腸桿菌中成功表達(dá)了P2a.3-30a，獲得了高效表達(dá)63kDa的重組蛋白，制備了抗血清，ACP-EL,ISA檢測發(fā)現(xiàn)效價(jià)達(dá)1：8192(1∶2<'13>)，western

6、-blot檢測發(fā)現(xiàn)特異性極好，表明上游1200bp為2a基因的主要抗原區(qū)。 病毒對寄主的致病性受到衛(wèi)星病毒明顯的影響，不同的衛(wèi)星病毒影響不一樣。本研究通過dsRNA技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)，M-CMV沒有衛(wèi)星病毒存在，直接否定了癥狀恢復(fù)與衛(wèi)星病毒間的關(guān)系。黃瓜花葉病毒是RNA病毒，突變機(jī)率相對較高，正是如此，出現(xiàn)了病毒株系繁多的局面。研究癥狀恢復(fù)機(jī)制，需要研究某些基因的有效變異，以其他株系來直接對比，可能因分化時(shí)間較長，難以找到與恢復(fù)相關(guān)的