黃瓜綠斑駁花葉病毒與甘蔗花葉病毒基因組測序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）是農(nóng)作物上的兩種重要病毒，其分布范圍廣，危害重，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。本論文主要圍繞CGMMV和SCMV兩個(gè)病毒的基因組測序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、SCMV單克隆抗體制備及其應(yīng)用等開展相關(guān)研究，取得如下研究結(jié)果:
　　1、7個(gè)CGMMV浙江分離物基因

2、組測序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　利用以CGMMV單抗為核心建立的dot-ELISA方法對(duì)采自浙江省不同地方的762份葫蘆科作物、4批葫蘆科作物種子及60份雜草樣品進(jìn)行CGMMV普查。結(jié)果顯示，葫蘆植株及其種子、西瓜植株及其嫁接苗、甜瓜植株等樣品中均檢測到CGMMV。另外，在田間雜草碎米芥和空心蓮子草中檢測到CGMMV的存在，這是CGMMV感染雜草的首次報(bào)道。根據(jù)CGMMV在浙江省的地理分布及不同作物上的發(fā)生情況，從中選取感染CGMM

3、V的4株西瓜植株、2株西瓜嫁接苗和1株甜瓜植株樣品進(jìn)行病毒全基因組克隆和測序，獲得了7個(gè)CGMMV浙江分離物全基因組序列。測序結(jié)果表明，CGMMV臺(tái)州西瓜分離物和建德西瓜分離物的全基因組序列長度分別為6425 bp和6423 bp，2個(gè)東陽西瓜分離物全基因組序列長度分別為6423 bp和6425 bp，蕭山西瓜嫁接苗和東陽西瓜嫁接苗分離物全基因組序列長度分別為6423 bp和6424 bp，CGMMV建德甜瓜分離物全基因組序列長度為64

4、23 bp。同源性分析發(fā)現(xiàn)這7個(gè)分離物全基因組核苷酸同源性在99.2～100％之間。結(jié)合GenBank登錄的24個(gè)CGMMV分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，除分離物Ec外，其它分離物根據(jù)地理來源的不同分為兩組，即亞洲分離物聚在組Ⅰ，歐洲分離物聚在組Ⅱ，表明CGMMV的種群分化極有可能受地理分布的影響。CGMMV全基因組核苷酸序列位點(diǎn)變異分析發(fā)現(xiàn)，其各個(gè)位點(diǎn)的變異率均在8％以下，大多集中在2～5％之間，表明CGMMV基因組較保守、變異較少

5、。CGMMV堿基替換突變類型分析顯示，其具有轉(zhuǎn)換(A(←→)G和C(←→)T)明顯強(qiáng)于顛換（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。發(fā)生在CGMMV基因組上的大多數(shù)變異均導(dǎo)致了非同義突變的產(chǎn)生，且由于堿基替換類型的強(qiáng)烈偏好性，一些氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)了高于30％的非同義替代率。選擇壓分析結(jié)果顯示，在復(fù)制相關(guān)蛋白186 kDa和129 kDa ORF中檢測到強(qiáng)烈的負(fù)向選擇壓，這與報(bào)道的發(fā)生在其它RNA病毒中的情況類似。

6、最后，分離物Ec的重組分析發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)重組檢測中分離物Ec作為重組體的可信度均較低。
　　2、SCMV云南分離物的基因組測序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　利用RT-PCR的方法檢測來自云南田間的1個(gè)玉米樣品，發(fā)現(xiàn)其感染SCMV。隨后進(jìn)行該分離物（命名為SCMV-YN）基因組克隆和測序，得到不合poly(A)長9598 bp的全基因組序列。這是SCMV云南玉米分離物在全基因組序列上的首次報(bào)道。基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，SCMV-YN分離物

7、的CI蛋白中典型的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域V1215LLLEPTRPL1224突變成了V1215LLIEPTRPL1224，NIb蛋白C末端的原核脂蛋白結(jié)構(gòu)域I2554LAFNYTLLSC2564突變成I2554IAFNYAMLSS2564。與GenBank登錄的28個(gè)SCMV分離物全基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SCMV-YN與河北玉米分離物SCMV-BD8的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它分離物，達(dá)到95.2％，且在這些分離物中，P1變異最大，C

8、I和PIPO相比其它ORFs保守得多?；谌蚪M核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示29個(gè)SCMV分離物被分為兩組，即組Ⅰ和組Ⅱ。且在兩大組內(nèi)部又各分為兩小組，分別為組Ⅰ A(Maize)、組ⅠB(Maize/Sugarcane)和組Ⅱ A(Maize/Sugarcane)、組Ⅱ B(Sugarcane)。且地理分布對(duì)分離物親緣關(guān)系的影響有所弱化，寄主來源對(duì)分離物親緣關(guān)系的影響依然存在。SCMV全基因組核苷酸位點(diǎn)變異分析發(fā)現(xiàn)，其各個(gè)位點(diǎn)變異程度

9、存在明顯波動(dòng)，大多集中在15～20％之間，表明SCMV基因組存在高變異率。SCMV堿基替換突變類型與報(bào)道的其它RNA病毒類似，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)換（A(←→)G和C(←→)T）明顯強(qiáng)于顛換（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。遺傳差異及基因流分析顯示，組Ⅰ和組Ⅱ分離物在所有ORFs中均存在顯著的遺傳差異;同時(shí)在P3、NIa-VPg、NIa-Pro和NIb-replicase等ORFs中檢測到頻繁的基因流。選擇壓分析顯示

10、，SCMV分離物編碼的所有ORFs均處于負(fù)向（凈化）選擇壓下，且CI ORF受到的負(fù)向選擇壓最大。重組分析顯示，29個(gè)SCMV分離物中7個(gè)分離物檢測到明顯重組。且對(duì)這7個(gè)分離物的重組區(qū)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除P3ORF外，其它區(qū)域均檢測到了重組。
　　3、SCMV-YN分離物單抗的制備及其應(yīng)用
　　用提純的SCMV-YN病毒粒子免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選與克隆成功獲得9株能分泌SCMV單抗的雜交瘤細(xì)胞株(6A1、6A1

11、2、10B11、12A10、15C12、19F3、21C12、21H3和22A2），并制備單抗腹水。9株單抗腹水的間接ELISA效價(jià)在10-6～10-7之間，抗體類型及亞類均為IgG1、kappa輕鏈。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，6A1、21H3和22A2這3個(gè)單抗對(duì)SCMV-YN和SCMV北京分離物均具有免疫反應(yīng)，說明它識(shí)別的是這兩個(gè)分離物外殼蛋白亞基的共同抗原決定簇;而10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這

12、5個(gè)單抗僅對(duì)SCMV-YN分離物具有免疫反應(yīng)，說明它識(shí)別的是SCMV-YN分離物外殼蛋白亞基的特異性抗原決定簇。6A12單抗在Western blot時(shí)不識(shí)別SCMV外殼蛋白等病毒結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)合其dot-ELISA結(jié)果推測該單抗識(shí)別的是針對(duì)構(gòu)象型的抗原決定簇。以制備的單抗為核心建立dot-ELISA檢測方法，并對(duì)其特性進(jìn)行分析。特異性分析顯示，6A1、21H3和22A2這3個(gè)單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測SCMV-Y

13、N和北京分離物時(shí)均呈陽性反應(yīng);而6A12、10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這6個(gè)單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測SCMV-YN和北京分離物時(shí)，僅對(duì)SCMV-YN分離物呈陽性反應(yīng)，這說明其可用于SCMV-YN分離物的株系鑒定和檢測。dot-ELISA方法分析單抗靈敏度顯示，6A1、15C12、10B11和21H3單抗對(duì)病葉的檢測靈敏度均達(dá)到1∶10240倍稀釋（w/v, g/mL），12A10和1