胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞源生長因子和趨化因子的高通量篩選和驗(yàn)證.pdf

1、胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的消化系統(tǒng)腫瘤，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率并不平衡，但病人總體5年死亡率超過80％，每年因胃癌死亡的人數(shù)居世界癌癥死亡病人的第二位，嚴(yán)重威脅著人類健康。新近，腫瘤研究中出現(xiàn)了一些新的思路和技術(shù)，例如對腫瘤微環(huán)境的再認(rèn)識以及蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展，將為胃癌發(fā)病機(jī)理和防治研究帶來新的契機(jī)。腫瘤組織微環(huán)境由功能性上皮、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)和間質(zhì)細(xì)胞三部分組成，后者主要包括成纖維細(xì)胞、各

2、種免疫細(xì)胞和血管/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞；此外，腫瘤細(xì)胞還可以合成、分泌到細(xì)胞外間隙中新的基質(zhì)成分。目前對腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識主要包括：1.微環(huán)境是細(xì)胞基因不穩(wěn)定性的來源，可以誘發(fā)基因突變和DNA損傷，并導(dǎo)致DNA修復(fù)通路失調(diào)；2.許多有明確致癌作用的理化因素(慢性炎癥、化學(xué)致癌物等)是通過破壞微環(huán)境的組織結(jié)構(gòu)、改變間質(zhì)細(xì)胞因子表達(dá)譜并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，從而刺激功能細(xì)胞發(fā)生惡變的；3.腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移所需的氧、營養(yǎng)成分和生長刺激信號被認(rèn)為是來

3、自于周圍的間質(zhì)細(xì)胞；4.在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，惡性細(xì)胞可以被誘導(dǎo)恢復(fù)分化狀態(tài)。5.ECM中存在的抗腫瘤成分，例如：腫瘤抑素(tumstatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)，已經(jīng)得到成功分離正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)?，F(xiàn)有的一些研究已經(jīng)表明，成纖維細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的研究有著重要意義和良好前景：1.成纖維細(xì)胞組織微環(huán)境中主要的間質(zhì)細(xì)胞，也是產(chǎn)生ECM(例如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原與纖維連接蛋白)和組織蛋白酶的主要細(xì)胞，處于“基質(zhì)母細(xì)胞”的地位；2.成纖

4、維細(xì)胞是正常組織結(jié)構(gòu)的“守護(hù)者”，存在抑制周圍上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的機(jī)制，已發(fā)生癌變的細(xì)胞在正常成纖維細(xì)胞環(huán)境下也可以向正常細(xì)胞分化；3.成纖維細(xì)胞還是上皮細(xì)胞增生、分化的“調(diào)控者”，成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后可以表達(dá)多種細(xì)胞因子、粘附分子直接作用于上皮細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、生長、血管生成、浸潤與轉(zhuǎn)移。因此，對腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞進(jìn)行深入研究必將有助于對腫瘤發(fā)生機(jī)制以及浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的理解以及新的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。
　　 鑒于

5、成纖維細(xì)胞具有組織特異性，哺乳動物成纖維細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，不同部位分離出來的成纖維細(xì)胞反映出明顯的部位多樣性。最近的研究表明，和不同譜系的白細(xì)胞的基因表達(dá)模式一樣，從16個不同部位分離出來的50個人成纖維細(xì)胞種群的基因表達(dá)模式也有部位的特異性，存在于不同部位的成纖維細(xì)胞分泌不同的胞外基質(zhì)成分、生長因子和分化因子。那么胃癌發(fā)生過程中是否存在組織特異的分泌因子或信號蛋白?是否還存在未知的、與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞生長因子?本項(xiàng)目擬從

6、胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞切入胃癌微環(huán)境的研究，體外培養(yǎng)和鑒定人胃粘膜成纖維細(xì)胞(HGMF)和胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(GCAF)，接著對從HGMF和GCAF從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)功能各方面進(jìn)行對比，證實(shí)二者確實(shí)存在顯著的生物學(xué)行為方面的差異，進(jìn)而利用人細(xì)胞因子芯片技術(shù)對HGMF和GCAF的培養(yǎng)上清液進(jìn)行分析，篩選出差異因子，選擇其中表達(dá)量較高，差異較明顯，且文獻(xiàn)報道與腫瘤密切相關(guān)的生長因子以及趨化因子用ELISA法在HGMF-GCAF上清液之間及

7、正常-胃癌血清間進(jìn)行驗(yàn)證。這些胃癌成纖維細(xì)胞來源的生長因子和趨化因子的表達(dá)差異提示胃癌微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，進(jìn)一步探討它們與胃癌類型、分期的關(guān)系，可能尋找GCAF表達(dá)和分泌的、與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。HGMF和GCAF功能上的差異研究將為下一步對兩者進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立HGMF和GCAF各自的蛋白表達(dá)譜并篩選出二者之間的差異蛋白提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，對HGMF和GCAF之間的差異蛋白進(jìn)行深

8、入的研究和分析，可能會發(fā)現(xiàn)新的、與胃癌密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞源因子。
　　 第一部分胃粘膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　 目的:原代培養(yǎng)和鑒定人胃粘膜成纖維細(xì)胞，并對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高培養(yǎng)成功率，使其適用于進(jìn)一步研究需要。
　　 方法:
　　 1.人胃粘膜成纖維細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)采用植塊法。
　　 2.人胃粘膜成纖維細(xì)胞的鑒定：分別用免疫組化方法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測角蛋白(k

9、eratin)、波形絲蛋白(vimentin)和結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)情況。
　　 3.人胃成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化；選擇培養(yǎng)表面、培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)液PH值三個因素，每個因素設(shè)三個水平，觀察不同組合條件下原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的游出情況。
　　 結(jié)論:
　　 1.人胃粘膜成纖維細(xì)胞的原代從取材、運(yùn)輸、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件等都有其特殊要求，原代培養(yǎng)的條件優(yōu)化后可行性和可重復(fù)性較高。
　　 2.通過原代培

10、養(yǎng)可以獲得高純度的人胃黏膜成纖維細(xì)胞。
　　 第二部分體外胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(GCAF)和人胃粘膜成纖維細(xì)胞(HGMF)形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性和功能差異分析
　　 目的:探討胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(GCAF)和人胃粘膜成纖維細(xì)胞(HGMF)在生物學(xué)特性和功能活性方面的差異。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞HE染色光鏡觀察和透射電鏡觀察HGMF和GCAF形態(tài)學(xué)上的差異。
　　 2.CCK-8法檢測兩者的增殖活

11、性并繪制生長曲線。
　　 3.BCA法檢測兩者的總蛋白。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測HGMF和GCAF的細(xì)胞周期。
　　 5.分別用CCK-8法、Tanswell小室檢測及流式細(xì)胞檢測GCAF條件培養(yǎng)基對胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖、侵襲能力和細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)論:原代培養(yǎng)的GCAF和HGMF在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖能力、總蛋白含量、細(xì)胞周期及其對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響等方面存在顯著差異。 第三部分 G

12、CAF和HGMF培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子芯片檢測及ELISA驗(yàn)證
　　 目的:篩選GCAF和HGMF源差異細(xì)胞因子并進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備：取1×106個生長良好的第3代GCAF和HGMF，以純RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清備用。
　　 2.RayBio(R)人細(xì)胞因子抗體芯片檢測GCAF和HGMF上清液中120種因子的表達(dá)量，采集圖象和數(shù)據(jù)，計(jì)算各抗體表達(dá)的

13、標(biāo)準(zhǔn)值。
　　 3.根據(jù)細(xì)胞因子芯片篩選結(jié)果選擇肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管生成素(Angiogenin)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、人細(xì)胞間粘附分子-1(sICAM-1)和人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、RANTES(Regulated upon activation，normalT cell expressed andsecreted)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic pro

14、tein1，MCP-1)、CCL16/HCC-4(Hemofiltrate CC Chemokine4)，CXCL9/MIG，人粘膜相關(guān)上皮趨化因子(MEC/CCL28)、GROα/CXCL1(growth-related oncogene)，用ELISA法在擴(kuò)大樣本量的HGMF-GCAF上清液之間及正常-胃癌血清間進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)論:GCAF與HGMF在部分細(xì)胞因子分泌水平上存在顯著差異，可能是兩者功能活性差異的重要生物學(xué)