GPMV F、HN及NP基因的多表達系統(tǒng)與DNA疫苗的研究.pdf

1、東北農業(yè)大學農學博士學位論文泳分析證實NP基因獲得了表達，大小約為80ku：薄層掃描分析結果表明，表達產物占菌體蟹向的382％；經Westenblot和Dot—ELISA分析證實表達的重組蛋白具有良好的抗原性，從而為鵝副粘病毒病的診斷奠定了必要的技術和物資基礎。將以上構建的三種DNA疫苗轉染293T細胞進行瞬時表達，結果在轉染后48h三種質粒均獲得了表達，且表達的蛋白可與抗GPMV的抗體發(fā)生特異性結合。于熒光顯微鏡下可見黃綠色的熒光，而

2、質粒pcDNA31及未轉染質粒的293T細胞均未見熒光出現，呈陰性反應。體外轉染實驗表明三種疫苗質粒均能在體外獲得表達，從而為下一步的動物試驗提供了必要的前提條件。為了評價所構建的三種DNA疫苗的免疫效果，分別將它們以每只雞100ug的劑量分兩點肌肉注射接種3周齡的雞，同時以質粒pcDNA3l和PBS以及油乳滅活苗作對照。3周后加強免疫，于加強免疫后2周以50LD50的GPMV肌肉注射攻毒(o2ml／只)，攻毒后每天觀察并詳細記錄雞只的

3、發(fā)病和死亡情況，并根據死亡數統(tǒng)計死亡率；各組免疫雞在首次免疫前、后(加強免疫前)、加強免疫后(攻毒前)及攻毒后1周分別采血，用H1和ELISA的方法檢測抗體的動態(tài)變化，同時檢測外周血CD4、CD8T淋巴細胞的動態(tài)變化。結果顯示：(1)攻毒前各DNA疫苗免疫組檢不到或只有很低的HI抗體，但攻毒后HN組的HI抗體效價迅速升高。(2)各DNA疫苗免疫組均不同程度的產生了ELISA抗體。(3)各DNA疫苗免疫組在免疫后外周血CD4、CD8T淋巴

4、細胞都有不同程度的升高。(4)攻毒保護試驗結果顯示：油乳滅活苗組的雞全部得到保護，載體對照組于36天全部死亡，DNA疫苗免疫綱的保護率分別是：F組為40％(4／10)、HN組為30％(3／10)、NP組為50％(5／10)，且DNA疫苗免疫組雞的死亡時間遲于對照組。通過本研究證實，所構建的DNA疫苗能夠誘導雞體的體液免疫和細胞免疫應答，對GPMV強毒的攻擊具有～定的保護作用。本研究成功的克隆了GPMVJS／1／97／Go分離株F、HN、

5、NP三段主要保護性抗原基因；利用基因重組技術構建了含有F、HN及雙基因的重組禽痘病毒轉移載體：對NP基岡進行了原核表達和表達蛋白反應原性的檢測；構建了含有GPMVJS／1／97／Go分離株F、bIN、NP三種保護性抗原基因的DNA疫苗并進行了體外瞬時表達和動物體內接種試驗?？傊?，通過本研究將為鵝副粘病毒病的診斷試劑和疫苗的研制提供科學的實驗依據，奠定良好技術基礎和物質儲備。關鍵詞：鵝副粘病毒；F基因fIIN基因fNP基因；原核表選；重組