SATB1對人乳腺癌多藥耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　化療作為乳腺癌手術(shù)治療的重要輔助手段，是利用化療藥物殺死腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖而發(fā)揮治療作用的。但臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化療并不是對每個(gè)乳腺癌患者都能起到預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的效果。原因是有些乳腺癌細(xì)胞與生具有對化療藥物的抵抗性，即原發(fā)耐藥;而另一些本來對藥物敏感的乳腺癌，在某些先期化療藥物的誘導(dǎo)下，出現(xiàn)了對多種不同分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的藥物同時(shí)具有耐藥性，即繼發(fā)耐藥，也稱多藥耐藥(multidrug resista

2、nce，MDR)。多藥耐藥基因MDR1編碼的蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，是一類分子量為170kD，依賴ATP供能的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子，能把抗腫瘤藥物從細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外，降低胞內(nèi)藥物濃度從而表現(xiàn)出對藥物的不敏感，是經(jīng)典多藥耐藥的分子機(jī)制，腫瘤細(xì)胞中MDR1的表達(dá)涉及到復(fù)雜的多因素相互作用。多藥耐藥還涉及到腫瘤細(xì)胞對凋亡刺激因子的抑制作用，以及腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性而逃避化療藥物的殺傷作用。
　　富AT序列特異

3、性結(jié)合蛋白1（Special AT-rich sequence binding protein1，SATB1）是一種組織特異性的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix attachment regions，MARs）結(jié)合蛋白，扮演基因組織者(genome organizer)的角色，通過重塑染色體的空間結(jié)構(gòu)而改變基因的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲性表型，促進(jìn)乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移，SATB1與乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。
　　我們的前期工作結(jié)果顯

4、示在乳腺癌中腫瘤的侵襲能力和多藥耐藥存在著功能聯(lián)系，但對于決定乳腺癌侵襲性的SATB1是否也影響到乳腺癌的多藥耐藥尚無報(bào)道，本研究目的是探討SATB1和MDR之間的關(guān)系及其分子機(jī)制。
　　第一部分 SATB1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與多藥耐藥的關(guān)系
　　目的：觀察SATB1與人乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥表型的關(guān)系，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用real-time PCR和western blot方法檢測乳腺癌藥物敏感株MCF7

5、細(xì)胞和耐藥株MCF7/ADR細(xì)胞中SATB1在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的差異;western blot檢測藥物敏感株細(xì)胞MCF7、Hs578T、MX-1及其對應(yīng)耐藥株細(xì)胞MCF7/MX、Hs578T/DOX、MX-1/T中，以及不同濃度阿霉素誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞株耐藥亞型中SATB1的蛋白表達(dá);采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞和SATB1-siRNA干擾MCF7/ADR細(xì)胞，用MTT法檢測阿霉素對MC

6、F7/ADR細(xì)胞經(jīng)干擾前后相對抑制率的改變;把經(jīng)SATB1轉(zhuǎn)染和干擾前后的乳腺癌細(xì)胞接種裸鼠，然后通過尾靜脈注射阿霉素，以腫瘤大小代表相對生長率來評估體內(nèi)阿霉素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
　　結(jié)果：乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR中SATB1的量在mRNA和蛋白水平均高于藥物敏感乳腺癌細(xì)胞株MCF7;藥物敏感細(xì)胞株MCF7、Hs578T、MX-1中SATB1蛋白表達(dá)低于其對應(yīng)耐藥株細(xì)胞MCF7/mitoxantrone(MCF7/MX

7、)、Hs578T/doxorubicin(Hs578T/DOX)、MX/Taxol(MX-1/T);在誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞耐藥亞型過程中SATB1的表達(dá)水平隨著阿霉素量的增大而升高;阿霉素對MCF7/ADR-SATB1RNAi細(xì)胞的相對抑制率明顯高于對照組MCF7/ADR細(xì)胞;阿霉素對裸鼠體內(nèi)的MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi細(xì)胞表現(xiàn)出比MCF7-SATB1和MCF/ADR-con細(xì)胞更強(qiáng)的抑制作用。
　　小結(jié)：

8、SATB1與人乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥表型有著密切的關(guān)系。
　　第二部分 P-gp在SATB1相關(guān)乳腺癌多藥耐藥中的作用
　　目的：探討SATB1對乳腺癌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。
　　方法：采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞和SATB1-siRNA干擾MCF7/ADR細(xì)胞采用，western blot檢測處理前后各細(xì)胞中P-gp、乳腺癌耐藥蛋白（breast c

9、ancer resistant protein，BCRP），多藥耐藥蛋白(multidrugresistant protein，MRP)1在蛋白水平的表達(dá);定量RT-PCR檢測個(gè)細(xì)胞中MDR1基因的轉(zhuǎn)錄水平;MTT法檢測各細(xì)胞對P-gp底物類及非P-gp底物類藥物的敏感性;用激光計(jì)數(shù)法檢測各細(xì)胞內(nèi)阿霉素的沉積評估藥物泵功能;用P-gp單抗處理MCF7-SATB1，MTT檢測其對化療藥ADM和MTX敏感性的變化;用免疫組化法檢測臨床乳腺癌

10、標(biāo)本中SATB1和P-gp表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：在MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con細(xì)胞中P-gp的表達(dá)高于MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi細(xì)胞，而MRP1和BCRP則無明顯改變。MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con細(xì)胞中MDR1mRNA的量高于MCF7-con和 MCF7/ADR-SATB1RNAi細(xì)胞。MCF7經(jīng)SATB1轉(zhuǎn)染后，對P-gp相關(guān)類藥物的抵抗性有明顯的升高，對非P-

11、gp相關(guān)類藥物則略有升高，而MCF7/ADR經(jīng)SATB1-siRNA干擾后則表現(xiàn)出對P-gp底物類藥物的敏感性增加和對非P-gp底物類藥物敏感性的選擇性升高;用阿霉素孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度均分別低于MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1 RNAi細(xì)胞;P-gp單抗可以部分逆轉(zhuǎn)SATB1轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞所致的對P-gp底物類藥ADM的抵抗作用，但不能逆轉(zhuǎn)對非P-gp底物類藥MTX

12、的抵抗作用;在臨床乳腺癌標(biāo)本中SATB1的表達(dá)和P-gp的表達(dá)是平行的。
　　小結(jié)：SATB1通過上調(diào)P-gp的表達(dá)而增強(qiáng)乳腺癌的多藥耐藥功能。
　　第三部分 SATB1對乳腺癌干細(xì)胞表型CD44+/CD24-的影響及SATB1在乳腺癌抗阿霉素所致凋亡中的作用
　　目的：探討SATB1在乳腺癌腫瘤干細(xì)胞及抗凋亡所致耐藥中的作用及機(jī)制。
　　方法：采用SATB1-siRNA雙鏈寡核糖核酸干擾MCF7/ADR、MDA

13、-MB-231細(xì)胞，采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)SATB1轉(zhuǎn)染、干擾前后乳腺癌干細(xì)胞表型CD44+/CD24-的表達(dá);阿霉素處理MCF7、MCF7/ADR及MCF7-SATB1、MDA-MB-231-SATB1RNAi，western blot檢測SATB1的表達(dá)，了解其裂解狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)及Casepase活性檢測術(shù)定量分析阿霉素所致乳腺

14、癌細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果：MCF7細(xì)胞經(jīng)SATB1轉(zhuǎn)染后，CD44+/CD24-比例明顯升高;MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)SATB1-siRNA干擾后，CD44+/CD24-比例明顯降低。MCF7/ADR-SATB1RNAi細(xì)胞經(jīng)阿霉素處理后出現(xiàn)了SATB1的裂解，接著進(jìn)入程序性死亡;阿霉素誘導(dǎo)的caspase活性在異位表達(dá)SATB1的MCF7細(xì)胞中明顯的下降了，而在敲除了SATB1的MCF7/ADR細(xì)胞中則明顯的升高了。