5-Fu誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系的建立及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:化學(xué)治療在乳腺癌綜合治療中起著非常重要的作用。然而,伴隨乳腺癌發(fā)生形成的原發(fā)性耐藥和乳腺癌化療過程中產(chǎn)生的繼發(fā)性耐藥一直困擾著乳腺癌的臨床治療。乳腺癌的化療耐受機(jī)制十分復(fù)雜,雖然各類文獻(xiàn)陸續(xù)有些報(bào)道,但至今仍無定論。本課題擬在建立5-Fu誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥(MDR)細(xì)胞系基礎(chǔ)上,篩選鑒定耐藥相關(guān)蛋白,探討MDR相關(guān)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),識(shí)別MDR新的標(biāo)志物,為進(jìn)一步闡述乳腺癌MDR機(jī)制,開展逆轉(zhuǎn)耐藥的靶向治療,提高乳腺癌化療效果提

2、供新的理論依據(jù)。
　　 方法:(1)采用低濃度梯度遞增結(jié)合大劑量間歇誘導(dǎo)方法建立5-Fu誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞系(MCF-7/5-Fu),采用MTT、Annexin-V和PI雙染后行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)以及實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot檢測耐藥細(xì)胞生物學(xué)特性及其與耐藥膜蛋白表達(dá)的關(guān)系；(2)采用蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和ESI-Q-TOF-MS串聯(lián)質(zhì)譜分析構(gòu)建MDR

3、相關(guān)蛋白表達(dá)譜；(3)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及小RNA干擾(RNAi)技術(shù)分別建立14-3-3σ穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系,MTT、Western-blot和免疫共沉淀檢測14-3-3σ表達(dá)對乳腺癌藥物敏感性的影響及其所介導(dǎo)的相關(guān)分子表達(dá)改變；(4)MTT法檢測5-Fu作用0,12,24,48h后MCF-7細(xì)胞存活情況,Western-blot檢測不同處理時(shí)間細(xì)胞中相關(guān)分子的表達(dá)改變,分析5-Fu作用與耐受的關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)5-

4、Fu反復(fù)誘導(dǎo)形成的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/5-Fu對5-Fu的耐藥指數(shù)(RI)達(dá)到5.21(p<0.01),抗凋亡能力明顯增強(qiáng),對MX、cDDP、ADM及TAXOL的耐藥指數(shù)分別為3.37(p<0.01)、3.21(p<0.01)、2.03(p<0.05)和1.81(p<0.05),對VP-16和THP的耐藥指數(shù)分別為1.35(p>0.05)和1.06(p>0.05),同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥蛋白BCRP在該耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),而多藥

5、耐受蛋白MDR1和MDR相關(guān)蛋白MRP1表達(dá)無明顯改變；(2)與親代MCF-7細(xì)胞相比,MCF-7/5-Fu細(xì)胞中EF-TU等12個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),14.3-3σ、HSC70、MnSOD和CK8等18個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；(3)MCF-7/5-Fu細(xì)胞中Akt磷酸化(p-Akt)水平增加,p53蛋白表達(dá)下調(diào),二者下游相關(guān)信號(hào)分子NF-kB-p50、Survivin及Bcl-2表達(dá)上調(diào),且這些分子改變均與14-3-3σ表達(dá)下調(diào)相關(guān)；(4)5-

6、Fu初期使用殺傷MCF-7細(xì)胞的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞14-3-3σ、p53表達(dá)上調(diào)和p-Akt,NF-kB-p50,Survivin、Bcl-2等蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:(1)首次建立一株由5-Fu誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系(MCF-7/5-Fu),并構(gòu)建了其耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)譜；(2)首次發(fā)現(xiàn)14-3-3σ可能通過抑制Akt磷酸化,促進(jìn)p53上調(diào),繼而抑制NF-kB、Survivin、Bcl-2及BCRP表達(dá)降低MCF-7/5-Fu