HGF-c-met調(diào)控肝素酶表達(dá)促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率在全世界特別是東亞國家如中國、韓國等地居高不下。最新文獻(xiàn)報(bào)道每年有640000男性和350000女性被診斷為胃癌。同時(shí)每年有464000男性和273000女性死于胃癌。90％腫瘤患者的死亡都是由于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移引起的。因此，有必要對胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行研究，以減緩患者的死亡。肝素酶(HPA)作為細(xì)胞內(nèi)唯一一種內(nèi)源性核苷內(nèi)切酶被認(rèn)為在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。肝素酶通過降解硫酸乙酰肝

2、素蛋白多糖，可以使綁定在細(xì)胞外基質(zhì)中的相關(guān)細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等的釋放，從而使其能夠結(jié)合于上皮細(xì)胞表面，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移。然而，目前有關(guān)調(diào)控肝素酶表達(dá)的分子機(jī)制研究較少。目前已經(jīng)證實(shí)在腫瘤組織中突變的或者失活的p53基因能夠促進(jìn)肝素酶的表達(dá)。同時(shí)，也有文獻(xiàn)證實(shí)SP1及 Ets家族在促進(jìn)肝素酶表達(dá)的過程中發(fā)揮重要作用。我們前期也

3、證實(shí)，靶向肝素酶的T細(xì)胞多肽疫苗能夠顯著抑制腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移，此結(jié)果提示肝素酶在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，有必要探索肝素酶在胃癌中表達(dá)的具體機(jī)制。
　　c-met作為一種癌基因廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的表面并且在多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、骨肉瘤及腦腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我們前期通過30例臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)c-met及HPA在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯增加，同時(shí)c-met和HPA在胃癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.

4、01)。同時(shí)，既往文獻(xiàn)報(bào)道，肝細(xì)胞生長因子(HGF)通過與c-met結(jié)合，能夠激活一系列信號通路如PI3K/Akt、ERK、NF-κB及STAT3進(jìn)而促進(jìn)靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。那么HGF/c-met信號通路是否可以促進(jìn)HPA的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，此研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本課題在國家自然科學(xué)基金的資助下。系統(tǒng)的研究了胃癌組織及細(xì)胞中HGF、c-met及HPA的表達(dá)情況，并從分子水平闡明了HGF/c-met可以

5、通過激活PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而活化NF-κB信號通路從而促進(jìn)p65入核，使其結(jié)合于HPA啟動子的-769~-760 bps區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)肝素酶的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.通過免疫組化檢測HGF及HPA在58例胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析HGF及HPA的表達(dá)與胃癌患者的臨床病理分期（性別，年齡，腫瘤大小，分化，TNM分期，侵潤深度及淋巴及轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。進(jìn)一步分析肝HGF與H

6、PA之間的相關(guān)性，研究HGF和HPA的表達(dá)與胃癌患者生存的關(guān)系。
　　2.通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分析外源性肝細(xì)胞生長因子分別刺激MKN74和MKN45細(xì)胞后，肝素酶mRNA和蛋白的表達(dá)變化情況。
　　3.肝細(xì)胞生長因子刺激MKN74和MKN45細(xì)胞的同時(shí)加入c-met特異性抑制劑Su11274，共同培養(yǎng)24小時(shí)。Western blot檢測肝素酶蛋白表達(dá)的變化。
　　4.肝細(xì)胞生長因子分別刺激

7、MKN74和MKN45細(xì)胞0，15，30，45，60，90分鐘后收集蛋白，Western blot檢測磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表達(dá)變化。進(jìn)一步加入PI3K/Akt的抑制劑GSK及NF-κB信號通路的抑制劑Bay，檢測磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表達(dá)變化。
　　5. HGF刺激MKN74細(xì)胞的同時(shí)分別加入Su11274，GSK和Bay后培養(yǎng)24小時(shí)，Western blot檢測肝素酶表達(dá)的變化情況。
　　6.雙熒光素酶

8、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肝細(xì)胞生長因子是否可以提高肝素酶啟動子的活性。
　　7.生物信息學(xué)預(yù)測p65與肝素酶啟動子結(jié)合的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　8.根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，進(jìn)一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀驗(yàn)證p65與肝素酶啟動子的具體結(jié)合位點(diǎn)。
　　9.CCK-8實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell實(shí)驗(yàn)及裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分析肝細(xì)胞生長因子及肝素酶在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　10.酶聯(lián)免疫法檢測過表達(dá)肝素酶后MKN74細(xì)胞和干擾肝素酶后MK

9、N45細(xì)胞的肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.證實(shí)HGF及HPA在58例胃癌組織中明顯高表達(dá)，并且與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在58例臨床標(biāo)本中HGF在胃癌組織的表達(dá)較癌旁組織中明顯增高（P<0.001）；HPA在胃癌組織中的表達(dá)亦較癌旁組織明顯升高（P<0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HGF高表達(dá)與胃癌患者的TNM分期，淋巴及轉(zhuǎn)移及侵潤深度密切相關(guān)。同時(shí)HPA高表達(dá)與胃癌患者的TNM分期及

10、侵潤深度密切相關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) HGF高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。同樣胃癌組織高表達(dá) HPA與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。最后，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)HGF及HPA在胃癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（R=0.7011，P<0.001）。
　　2. HGF刺激能夠明顯增加MKN74細(xì)胞HPA的表達(dá)，但對MKN45胃癌細(xì)胞HPA的表達(dá)則沒有影響。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入肝細(xì)胞生長因子刺激1小時(shí)后，MKN74細(xì)胞的肝素酶表達(dá)明顯增加

11、。然而肝細(xì)胞生長因子刺激對MKN45細(xì)胞肝素酶mRNA表達(dá)沒有影響。Western blot同樣發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子刺激能夠顯著增加MKN74細(xì)胞肝素酶蛋白的表達(dá)，但對MKN45細(xì)胞沒有影響。肝細(xì)胞生長因子刺激同時(shí)加入c-met抑制劑Su11274后MKN74和MKN45細(xì)胞的肝素酶的表達(dá)明顯下降。
　　3.證實(shí)HGF/c-met通過激活PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路促進(jìn)HPA的表達(dá)。Western blot發(fā)現(xiàn)

12、HGF刺激MKN74細(xì)胞30分鐘后磷酸化AKT的表達(dá)明顯增加，而刺激45分鐘后磷酸化p65的表達(dá)明顯增加。進(jìn)一步在HGF刺激MKN74細(xì)胞的同時(shí)，加入GSK及Bay后發(fā)現(xiàn)，Bay對磷酸化AKT的表達(dá)沒有影響而GSK能夠明顯抑制磷酸化p65的表達(dá)。由此說明，肝細(xì)胞生長因子首先激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而激活下游的NF-κB信號通路。進(jìn)一步HGF刺激MKN74細(xì)胞的同時(shí)加入Su11274，GSK和Bay后共同培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入抑制劑

13、后肝素酶的表達(dá)明顯減少。以上結(jié)果充分說明，肝細(xì)胞生長因子通過激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而激活下游的NF-κB信號通路促進(jìn)肝素酶的表達(dá)。
　　4.證實(shí)p65通過結(jié)合于肝素酶啟動子促進(jìn)HPA的表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝細(xì)胞生長因子能夠明顯增加肝素酶啟動子活性。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，p65在肝素酶的啟動子區(qū)有3個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建相關(guān)引物后通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p65能夠特異性的結(jié)合于肝素酶啟動子-769～-76

14、0 bps區(qū)，但并不能結(jié)合于其他兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步我們構(gòu)建了缺失突變-769～-760 bps區(qū)的肝素酶啟動子，再次進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子并不能提高突變后的肝素酶啟動子活性。以上結(jié)果充分證實(shí)p65通過結(jié)合于肝素酶啟動子-769～-760bps區(qū)促進(jìn)其表達(dá)。
　　5.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF/c-met-HPA信號通路在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF能夠顯著促進(jìn)MKN74細(xì)胞的侵

15、襲轉(zhuǎn)移能力，而其對MKN45細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移則沒有影響。但是HGF刺激的同時(shí)加入Bay后，MKN74和MKN45細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力均明顯下降。由此說明，HGF及NF-κB信號通路在胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步當(dāng)在MKN74細(xì)胞過表達(dá)肝素酶后，Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)肝素酶后MKN74細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。而在MKN45細(xì)胞中干擾肝素酶后其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。以上結(jié)果證實(shí)肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在體

16、內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，干擾肝素酶表達(dá)的MKN45細(xì)胞在小鼠腹腔形成的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量較對照組的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量及大小明顯減少，再次通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　　6.證實(shí)HPA可以反向調(diào)控HGF的表達(dá)。在MKN74細(xì)胞中過表達(dá)肝素酶后，上清中的肝細(xì)胞生長因子表達(dá)較對照組明顯升高。相反，在MKN45細(xì)胞中干擾肝素酶后，上清中的肝細(xì)胞生長因子表達(dá)較對照組明顯降低。以上結(jié)果充分說明，肝素酶可以反向調(diào)控肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)。
　

17、　結(jié)論：
　　1.HGF和HPA在胃癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織(p<0.001)，并且與患者的不良預(yù)后預(yù)后密切相關(guān)；HGF和HPA在胃癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(R=0.7011，p<0.001)。外源性HGF通過與c-met結(jié)合促進(jìn)MKN74細(xì)胞肝素酶的表達(dá)，但對MKN45細(xì)胞沒有影響。
　　2.HGF結(jié)合于c-met激活PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路促進(jìn)肝素酶的表達(dá)。p65入核后結(jié)合于肝素酶啟動子-

18、769～-760bps區(qū)促進(jìn)肝素酶的表達(dá)。
　　3.HGF及肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　　4.肝素酶可以反向調(diào)控HGF的表達(dá)，從而形成正向反潰調(diào)控通路，在胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　總之，通過本課題我們證實(shí) HGF通過結(jié)合于其特異性受體c-met激活 PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路，進(jìn)而使p65入核后結(jié)合于肝素酶的啟動子促進(jìn)其表達(dá)。另外肝素酶可以反向調(diào)控肝細(xì)胞生長因子的